Y染色体AZFc区域部分缺失与精神发育迟滞伴小阴茎关联性分析

王 珺 刘 芳 谢 华 吴欣洁 金春华 陈晓丽



·论著·

Y染色体AZFc区域部分缺失与精神发育迟滞伴小阴茎关联性分析

王 珺1刘 芳2谢 华2吴欣洁3金春华4陈晓丽2

目的采用基因芯片技术筛查精神发育迟滞伴小阴茎男童的基因组微失衡，探讨Y染色体无精子症因子C区(AZFc)部分缺失对其的致病性。方法提取1例精神发育迟滞伴小阴茎男童(先证者)及其父亲外周血DNA，利用CytoOneArray 染色体芯片行全基因组微失衡初筛，之后采用定制4×180K SNP+CNV精神发育相关芯片行全基因组微失衡筛查。选择特异性STS标签sY1191，sY1291作为引物，利用PCR特异性扩增11例正常男童，9/20例4×180K SNP+CNV芯片检测异常的精神发育迟滞未伴小阴茎男童，先证者及其父亲的Y染色体AZFc区域。 进一步对170例精神发育迟滞未伴小阴茎男童行PCR扩增，分析AZFc区域缺失频率。结果①CytoOneArray 染色体芯片检测发现先证者存在AZFc区域全缺失(chrY:24646690-28103711)，定制4×180K SNP+CNV精神发育相关芯片排除其他精神发育相关基因组微失衡，发现AZFc区域部分缺失(chrY:24873066-25203027；chrY:25850255-26245019)，结果不同于CytoOneArray 染色体芯片。②20例精神发育迟滞伴小阴茎男童行4×180K CNV+SNP芯片检测，5例存在Y染色体AZFc区域部分缺失，但缺失起止点不同；4例为已知的致精神发育异常的基因组微失衡。③PCR验证表明先证者及其父亲为AZFc区域b2/b3缺失，此片段缺失同时存在于1/11例正常男童、4/9例精神发育迟滞未伴小阴茎男童。④精神发育迟滞未伴小阴茎男童AZFc区域b2/b3缺失频率为15.1%(27/179)。结论AZFc区域b2/b3缺失可能不是精神发育迟滞伴小阴茎男童的致病病因，此AZFc区域部分缺失在中国人群中为多态性位点。

精神发育迟滞； AZFc区域部分缺失； 多态性位点； 基因芯片技术

精神发育迟滞发病率约为3%[1]，其临床表型具有高度异质性且发病原因复杂，目前仍有40%～60%病因不明[2]。近年来随着微阵列基因芯片技术在精神发育异常疾病中的应用，发现基因组微失衡是一系列精神发育疾病(精神发育迟滞、孤独症、精神病、双相情感障碍、注意力缺陷多动障碍等)的重要遗传因素，20%～25%中重度精神发育迟滞患者携带基因组微失衡[3]。

Y染色体无精子症因子C区(AZFc)有6种扩增子，为顺向重复和反向重复序列，容易发生非等位同源重组，进而导致AZFc区域全缺失和部分缺失[4～7]。AZFc区域全缺失为b2/b4缺失，即缺失发生在扩增子b2～b4[5]，研究认为AZFc区域全缺失具有生精障碍风险[4,5]。部分缺失最常见的为gr/gr缺失，其次为b2/b3缺失。AZFc区域部分缺失与生精障碍的关系仍存在争议[8～12]。AZFc区域微失衡在精神发育迟滞患儿中未见报道。本文对1例精神发育迟滞伴小阴茎男童(先证者)的AZFc区域部分缺失行全基因组微失衡筛查，并对精神发育迟滞不伴小阴茎男童行微失衡检测，进一步以PCR扩增验证AZFc区域的部分缺失，探讨该区域缺失的致病性。

1 病例报告

先证者，男，汉族，2007年6月11日出生。剖宫产娩出，出生体重2 kg，身长40 cm，足月小于胎龄儿。生后喂养困难，3岁后改善。抬头、坐、站、走均晚于正常同龄儿童，未观察到生长发育倒退。无定向思维，无法正常交流。中国韦氏智力量表IQ评分为31分，婴儿-初中生社会适应性能力量表测定为重度异常。父母身体健康，非近亲婚配，无遗传性疾病和精神发育迟滞。母亲本次妊娠年龄为29岁，足月分娩，无自然流产史和人工流产史。孕期未使用药物，无毒物和毒品等接触史，无妇科感染史，无吸烟史。

患儿6岁时来首都儿科研究所(我院)就诊。查体：体重14 kg(

经患儿家长同意和我院伦理委员会审核，采集患儿及其父亲静脉血用QIAGEN(Cat.No.51104)试剂盒提取外周血DNA，检测DNA浓度和纯度，于-20℃保存。采用CytoOneArray染色体芯片(中国台湾华联生物科技有限公司)行基因组微失衡初筛，芯片探针以特定疾病区域为主，探针间距10～30 kb；在非特定区域探针间距为2 Mb，总探针数为26 217。检测结果为chrY:24646690-28103711区域缺失(图1A)，即AZFc区域全缺失。

同时采用4×180K CNV+SNP芯片检测全基因组微失衡(美国波士顿儿童医院临床分子诊断实验室设计)，探针覆盖重要孟德尔遗传基因(特别是发育迟缓、孤独症、精神发育迟滞相关基因)、单倍型不足导致疾病的相关基因、剂量相关基因、明确的转录因子、神经系统发育相关基因，其中有287个为OMIM中报道的微缺失/微重复的位点，680个为疾病相关位点，同时覆盖亚端粒和近中心粒区域。并针对精神神经系统发育相关区域(16p11.2、15q11.2-13.1、17p11.2、SHANK3、NRXN1)进行高密度探针覆盖(探针间距6～8 kb，与1 M芯片相似)。该芯片在AZFc区域有553个探针，探针在AZFc区域分布见图2。按照美国波士顿儿童医院临床分子诊断实验室的标准方法[13]进行检测。检测缺失区域为chrY:24873066-25203027；chrY:25850255-26245019，即AZFc区域部分缺失，同时存在AZFc区域部分重复(chrY:25288251-256028060)(图1B)。患儿父亲行4×180K CNV+SNP芯片检测，与患儿AZFc区域微失衡检出结果一致。

图1 本文精神发育迟滞伴小阴茎病例AZFc区域的芯片结果

Fig 1 The chip data of the AZFc of the boy with intellectual disability and micropenis

Notes A,B: The data of CytoOneArray chip and 4×180K CNV+SNP chip respectively. Each probe was represented as a single dot and plots on X axis according to its genome position. Duplication/deletion was shown respectively as red/green dot and normal as black one

2 AZFc区域部分缺失致病性分析

2.1 精神发育迟滞不伴小阴茎患儿的AZFc区域部分缺失分析 本文病例及其父亲均携带相同Y染色体的AZFc区域微失衡，但患儿父亲并无精神发育迟滞、无精症或小阴茎等表型，Y染色体的AZFc区域微失衡的致病性可疑。为此本文选择20例我院采用盖塞尔发育量表、韦克斯勒儿童智力量表、韦克斯勒学龄前和学龄初期智力量表、中国韦氏智力量表和婴儿-初中生社会适应性能力量表[14]诊断的精神发育迟滞，未伴小阴茎，并除外遗传病筛查排除染色体核型异常者、脆性X染色体综合征、先天性代谢病病例，行4×180K CNV+SNP芯片筛查，其中5例存在Y染色体AZFc区域部分缺失，但缺失起止点不同(图3)，该5例Y染色体AZFc区域部分缺失病例均未携带其他精神发育相关基因组微失衡[15]；余15例发现4个已知的致精神发育异常的基因组微失衡，包括16p11.2微缺失、7q11.23微缺失、22q11.21微缺失、Xq22.1-2.3微重复。

图2 Y染色体的AZFc区域的探针、基因内容、STS位点位置分布以及患儿微失衡分布

Fig 2 The probe,gene and STS of the AZFc region on Y chromosome and the AZFc region microimbalance of the patient

Notes A: The red bar showed the complete AZFc deletion from the patient with the CytoOneArray chip. B: The AZFc microduplication/microdeletion was shown respectively as red/green bar with the 4×180K CNV+SNP chip. C: showed the probe location in the AZFc of the 4×180K CNV+SNP.The arrow indicated the position of sY1191 and sY1291

图3 5例ID未伴小阴茎病例AZFc区域4×180K SNP+CNV芯片检测结果

Fig 3 The 4×180K SNP+CNV chip data of the AZFc of 5 boy with intellectual disability but no micropenis

Notes A: Chr Y: 24799030-26275993; B: ChrY:24873066-25203027; C: Chr Y:24873066-25203027, 25383895-25404110; D: Chr Y:24873066-25197319,26148501-26196672; E: Chr Y: 24082678-25811466

2.2 PCR扩增验证AZFc区域部分缺失 由于Y染色体AZFc区域基因序列均具有高度的同源性，芯片无法对Y染色体重组进行精确的基因组定位，而当染色体上的某个区域有缺失发生时，这段区域连锁的特异性的STS位点会被一同去除[11]。因此选择该区域特异性的STS位点来标记基因组重组。根据AZFc区域缺失形成原理和既往研究，AZFc区域全缺失时表现为阴性的STS位点有sY254、sY639、sY1054、sY1191、sY1206和sY1291[11]；在AZFc区域b2/b3缺失时表现为阴性的STS位点有sY1191[7]。AZFc区域gr/gr缺失时表现为阴性的STS位点有sY1291[6]。提示在上述STS位点中，sY1191和sY1291具有最大的信息量，设计引物(上海生工生物技术有限公司合成)，SY1191正向：5′-CCAGACGTTCTACCCTTTC-G-3′，反向：5′-GAGCCGAGATCCAGTTACCA-3′，均为385 bp；SY1291正向：5′-TAAAAGGCAGAACTGCCAGG-3′，反向：5′-GGGAGAAAAGTTCTGCAACG-3′，均为527 bp。行特异性PCR扩增对AZFc区域部分缺失进行验证。PCR反应结束取PCR扩增产物加入含溴酚蓝上样缓冲液，2%琼脂糖凝胶电泳，紫外线检测仪观测扩增条带。

选择我院健康查体男童常规血生化检查的剩余血标本11份、9例上述4×180K CNV+SNP芯片结果显示异常的精神发育迟滞未伴小阴茎男童和先证者及其父亲行PCR扩增，结果显示先证者及其父亲仅sY1191缺失提示AZFc b2/b3缺失，4/9例精神发育迟滞未伴小阴茎患儿伴AZFc b2/b3缺失，1/11例正常男童伴AZFc b2/b3缺失(图4)。

图4 Y染色体AZFc区域部分缺失电泳图

Fig 4 Electrophoresis of partial deletion of the AZFc region with primer sY1191and sY1291

Notes A: SY1191; B: SY1291. Lane P:the boy with intellectual disability and micropenis;Lane P-F:the father of the boy with intellectual disability and micropenis;Lane 1-9:9 boys with intellectual disability but without micropenis;Lane 10-20:normal boys; Lane F:female;Lane B:Blank

2.3 精神发育迟滞未伴小阴茎男童AZFc区域部分缺失频率分析 PCR结果显示，精神发育迟滞未伴小阴茎男童AZFc区域 b2/b3缺失频率(4/9)明显高于正常男童(1/11)，考虑可能与仅选择CNV+SNP芯片结果异常的9例患儿进行分析有关，故进一步对170例精神发育迟滞未伴小阴茎男童(入选和排除标准同前)行PCR特异性扩增，结合上述的9例芯片结果异常的精神发育迟滞未伴小阴茎男童的PCR结果，AZFc b2/b3缺失频率为15.1%(27/179)。

3 讨论

精神发育迟滞/发育迟缓作为一组表型、基因型高度异质性的疾病，遗传病因复杂。高通量生物信息检测技术，目前在欧美国家作为各类精神发育迟滞/发育迟缓患儿的必检项目[16,17]。国内也有研究表明基因芯片技术可帮助诊断某些与精神发育迟滞/发育迟缓相关，但临床表型不典型的综合征，为部分不明原因的精神发育迟滞/发育迟缓患儿提供准确的遗传病因诊断[17]。

本文应用基因芯片技术检测1例精神发育迟滞伴小阴茎男童的基因组微失衡，CytoOneArray 染色体芯片检测发现AZFc区域全缺失，4×180K CNV+SNP芯片检测为AZFc区域部分缺失，且患儿父亲携带有相同的基因组微失衡。基于Y染色体AZFc区域缺失形成原理，本文采用特异性STS标签sY1191，sY1291作为引物进行PCR来验证芯片检测结果，并分析AZFc区域缺失致病性。PCR结果表明该患儿为b2/b3缺失，因此推测在检测AZFc区域基因拷贝数变异时CytoOneArray 染色体芯片分辨率不足，其探针数仅为26 217，远低于4×180K CNV+SNP芯片的18万探针数。Yuen等[18]研究也发现高分辨率的微阵列芯片能够提高AZFc区域部分缺失的检出率，与本研究结果相一致。这提示临床医生在解读芯片结果时，需要考虑芯片探针密度以及探针分布特点，而不能单纯依靠检测结果给予诊断。

目前AZFc区域b2/b3缺失研究较多的是其对生精障碍的致病性，但两者的关系仍存在争议[8～12]。有研究发现b2/b3缺失与精子发生障碍间的关联性存在群体差异，可能是不同人群Y染色体单倍体型不同有关[19]。本文精神发育迟滞伴小阴茎男童及其正常表型的父亲、精神发育迟滞未伴小阴茎男童和正常男童均发现AZFc区域b2/b3缺失，因此推测AZFc区域b2/b3缺失可能并不是精神发育迟滞伴小阴茎的致病病因。同时179例精神发育迟滞不伴小阴茎男童的AZFc区域b2/b3缺失频率为15.1%(27/179)，与正常男童的9.1%(1/11)相近，提示该AZFc区域部分缺失在中国人群中为多态性位点。

本文精神发育迟滞伴小阴茎男童还检出AZFc区域部分重复，重复区域主要为DAZ基因。Lu等[20]研究显示b2/b3缺失伴DAZ基因重复具有生精障碍风险。本文患儿父亲表型正常，存在b2/b3缺失伴DAZ基因重复，推测b2/b3缺失伴DAZ基因重复对该患儿小阴茎的表型无致病性。值得注意的是AZFc区域b2/b3缺失可以遗传给后代[21,22]，且b2/b3缺失会增加后代发生AZFc区域全缺失的风险[11]，有生精障碍风险，因此如存在该缺失的患儿能够正常生育，也应检测其后代AZFc区域缺失情况，以便可以早期进行临床干预。

AZFc区域 b2/b3缺失为中国人群多态性位点，基于在精神发育迟滞伴小阴茎患儿中并未发现致精神发育相关CNV，推测精神发育相关基因的点变异是其可能的致病原因。

[1]Shevell M, Ashwal S, Donley D, et al. Practice parameter: Evaluation of the child with global developmental delay Report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology and The Practice Committee of the Child Neurology Society. Neurology, 2003, 60(3): 367-380

[2]Shaffer LG. American College of Medical Genetics guideline on the cytogenetic evaluation of the individual with developmental delay or mental retardation. Genet Med, 2005, 7(9): 650-654

[3]Beaudet AL. The utility of chromosomal microarray analysis in developmental and behavioral pediatrics. Child Dev, 2013, 84(1): 121-132

[4]Kuroda-Kawaguchi T, Skaletsky H, Brown LG, et al. The AZFc region of the Y chromosome features massive palindromes and uniform recurrent deletions in infertile men. Nat Genet, 2001, 29(3): 279-286

[5]Vog PH, Edelmann A, Kirsch S, et al. Human Y chromosome azoospermia factors (AZF) mapped to different subregions in Yq11. Hum Mol Genet,1996, 5(7): 933-943

[6]Repping S, Skaletsky H, Brown L, et al. Polymorphism for a 1.6-Mb deletion of the human Y chromosome persists through balance between recurrent mutation and haploid selection. Nat Genet, 2003, 35(3): 247-251

[7]Repping S, van Daalen SK, Korver CM, et al. A family of human Y chromosomes has dispersed throughout northern Eurasia despite a 1.8-Mb deletion in the azoospermia factor c region. Genomics, 2004, 83(6): 1046-1052

[8]Lynch M, Cram DS, Reilly A, et al. The Y chromosome gr/gr subdeletion is associated with male infertility. Mol Hum Reprod, 2005, 11(7): 507-512

[9]Hucklenbroich K, Gromoll J, Heinrich M, et al. Partial deletions in the AZFc region of the Y chromosome occur in men with impaired as well as normal spermatogenesis. Hum Reprod, 2005, 20(1): 191-197

[10]Wu B, Lu NX, Xia YK, et al. A frequent Y chromosome b2/b3 subdeletion shows strong association with male infertility in Han-Chinese population. Hum Reprod, 2007, 22(4): 1107-1113

[11]张锋. 人类Y染色体AZFc区结构变化对精子发生的影响. 复旦大学, 2007

[12]Xiao XS(肖晓素), Jiang LQ, Wang TY,et al. Study on the relationship between partial deletions in the azzospermia factor C region of Y chromosome and male infertility. Chinese Journal of Medical Genetics(中华医学遗传学杂志), 2010 (3): 294-298

[13]Vissers LE, de Vries B, Osoegawa K, et al. Array-based comparative genomic hybridization for the genomewide detection of submicroscopic chromosomal abnormalities. Am J Hum Genet, 2003, 73(6): 1261-1270

[14]吴希如,林庆,主编.小儿神经系统疾病基础与临床(第2版).北京:人民卫生出版社,2009.1004-1006

[15]Chen XL(陈晓丽), Guo J, Wang J. Genomic copy number variations ln children with unexplained mental retardation and developmental delay detected by array-comparative genomic hybridization. Chin J Evid Based Pediatr(中国循证儿科杂志), 2010, 5(2): 85-93

[16]Shaw-Smith C, Redon R, Rickman L, et al. Microarray based comparative genomic hybridisation (array-CGH) detects submicroscopic chromosomal deletions and duplications in patients with learning disability/mental retardation and dysmorphic features. J Med Genet, 2004, 41(4): 241-248

[17]Vissers LE, de Vries B, Veltman JA. Genomic microarrays in mental retardation: from copy number variation to gene, from research to diagnosis. J Med Genet, 2010, 47(5): 289-297

[18]Yuen RK, Merkoulovitch A, MacDonald JR, et al. Development of a high-resolution Y-chromosome microarray for improved male infertility diagnosis. Fertil Steril,2014,101(4):1079-1085

[19]Navarro-Costa P, Goncalves J, Plancha CE. The AZFc region of the Y chromosome: at the crossroads between genetic diversity and male infertility. Hum Reprod Update, 2010, 16(5): 525-542

[20]Lu C, Zhang F, Yang H, et al. Additional genomic duplications in AZFc underlie the b2/b3 deletion-associated risk of spermatogenic impairment in Han Chinese population. Hum Mol Genet, 2011, 20(22): 4411-4421

[21]Zhu XB( 朱晓斌),Li Z, Guo AL, et al. Study on the vertical transmission of Y chromosome microdeletions from father to son. Chin J Med Genet(中华医学遗传学杂志), 2007, 24(2): 203-205

[22]Kühnert B, Gromoll J, Kostova E, et al. Case Report: Natural transmission of an AZFc Y-chromosomal microdeletion from father to his sons. Hum Reprod, 2004, 19(4): 886-888

(本文编辑：丁俊杰)

2015中国医师协会儿科医师分会风湿免疫年会通知

由中国医师协会主办，中国医师协会儿科医师分会和复旦大学附属儿科医院承办的2015中国医师协会儿科医师分会风湿免疫年会，将于2015年10月30日至11月1日在上海召开，同期举办由首都儿科研究所和复旦大学附属儿科医院承办的2015全国儿童风湿免疫病新概念研修班(国2015-06-01-217)。会议面向基层医师，将邀请国内知名儿科风湿免疫学专家就儿童关节炎、狼疮、预防接种不良反应、儿童过敏症、免疫缺陷和儿童反复感染等内容，进行大会报告、专题会议和专题研讨。参加人员将授予国家级继续医学教育项目学分。欢迎从事儿童风湿、免疫相关领域儿科医生包括计划免疫工作人员踊跃参加。

有意参与本次会议的医生请与复旦大学附属儿科医院临床免疫科(上海市闵行区万源路399号)孙金峤医生联系，E-mail: jinqiaosun@sina.com。

The pathogenetic role of partial deletions of the azzospermia factor C region on Y chromosome in a boy with intellectual disability and micropenis

WANGJun1,LIUFang2,XIEHua2,WUXin-jie3,JINChun-hua4,CHENXiao-li2

(1DepartmentofNeurology,CapitalInstituteofPediatrics,Beijing100020；2DepartmentofMoelcularImmunology,CapitalInstituteofPediatrics,Beijing100020；3PhalanxBiotechGroup,Beijing10010; 4DepartmentofHealthCare,CapitalInstituteofPediatrics,Beijing100020,China)

CHEN Xiao-li，E-mail:cxlwx@sina.com

ObjectiveTo detect the copy number variation (CNV) with gene chip , and to explore the pathogenic role of partial deletions of the azoospermia factor C region on Y chromosome in a boy with intellectual disability and micropenis.MethodsWith the extracted DNA, CytoOneArray Chromosome chip was performed to preliminarily screen the copy number variation (CNV) of a boy with intellectual disability and micropenis.Then 4×180K SNP+CNV chip was used to detect the CNV. Polymerase chain reaction was used to detect the pathogenic role of partial deletions in the AZFc region in 11 normal boys, 9 boys were with intellectual disability but no micropenis, in a boy with intellectual disability and micropenis and his father, with the sY1191and sY1291 as the primer. PCR amplification was used in 179 boys with intellectual disability but no micropenis to analyze the frequency of AZFc deletion.ResultsFor the boy with intellectual disability and micropenis, complete gene AZFc deletion (chrY:24646690-28103711)was found using CytoOneArray Chromosome chip. Excluding other mental development related CNV, 4×180K SNP+CNV chip was used and AZFc partial deletions(chrY:24873066-25203027; chrY:25850255-26245019) were detected, while b2/b3 deletion was found with polymerase chain reaction. The b2/b3 deletion was also found in a normal boy and the boy with intellectual disability but no micropenis. ④ The frequency of AZFc deletion in 170 boys with intellectual disability but no micropenis was 15.1%(27/179).ConclusionOnly b2/b3 deletion may be not pathogenic for the boy with intellectual disability and micropenis, just as the polymorphism in Chinese population.

Mental retardation； Partial deletions of the azzospermia factor C region； Polymorphism； DNA-chip Technologies

国家科技支撑计划课题:首发2014-2-1131; 2014年首都卫生发展科研专项项目; 2012年北京市留学人员科技活动择优资助项目; 首都临床特色应用研究:Z131107002213159; 儿童常见疾病先进诊疗及适宜技术研发和示范:2012BAI03B02

1 首都儿科研究所神经科 北京，100020；2 首都儿科研究所分子免疫实验室 北京，100020；3 华联(Phalanx)生物科技公司 北京，100101；4 首都儿科研究所儿童保健科 北京，100020

陈晓丽，E-mail:cxlwx@sina.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2015.04.005

2014-10-03

2014-11-19)