2006至2014年北京单中心儿童乙型流感病毒流行监测

王 芳 孙 宇 赵林清 邓 洁 田 润 钱 渊 朱汝南



·论著·

2006至2014年北京单中心儿童乙型流感病毒流行监测

王 芳 孙 宇 赵林清 邓 洁 田 润 钱 渊 朱汝南

目的了解北京单中心儿童乙型流感病毒的流行趋势，为流感的防控提供数据支持。方法2006年9月至2014年5月对首都儿科研究所附属儿童医院门诊和急诊采集流感样病例的咽拭子标本，采用传代狗肾细胞(MDCK细胞)行流感病毒和副流感病毒的分离，并用特异性血清对分离到的流感病毒进行凝集抑制试验鉴定型别。同时接种人喉癌细胞(HEp-2)行呼吸道合胞病毒和腺病毒的分离。分为8个监测年度，以2006年9月至2007年8月(2006至2007年)为1个监测年度，余7个年度类推。对8个监测年度乙型流感病毒的流行特征行描述性分析，并与同期甲型流感病毒的流行特点进行比较。结果6 150份咽拭子标本检测了流感病毒，分离到乙型流感病毒345株(5.6%)，其中166株(48.1%)B/V系毒株和179株(51.9%)B/Y系毒株。①8个监测年度，出现5个乙型流感病毒的流行高峰。除2006至2007年外， 2007至2008、2009至2010、2011至2012和2013至2014年的流行高峰呈隔年流行的特点，月阳性率最高可达46.2%(2008年1月和2012年2月)。2006至2007、2009至2010、2010至2011和2013至2014年，甲型流感病毒阳性率高于乙型流感病毒，且乙型流感流行高峰均出现在甲型流感流行高峰后；2007至2008和2011至2012年，乙型流感病毒阳性率高于甲型流感病毒，且乙型流感病毒流行高峰均出现在甲型流感流行高峰前。②8个监测年度中2006至2007、2007至2008、2010至2011和2011至2012年B/V系和B/Y系乙型流感病毒同时流行，余4个年度为其中之一流行株流行。2009至2010、2011至2012和2013至2014年的流行株与WHO推荐的流感疫苗中的乙型流感病毒型别相匹配。③345例乙型流感病毒阳性患儿中，～12岁以下组中随着患儿年龄增大而乙型流感病毒阳性率增高。结论2006年9月至2014年5月北京地区儿童乙型流感病毒的流行基本呈现隔年出现高峰的流行趋势。在2个谱系同时流行的4个流行季中，分别以B/V或B/Y系乙型流感病毒为主要流行株。

乙型流感病毒； 流感样病例； 儿童； 谱系； 病毒分离

目前感染人类并引起流行的流感病毒主要是甲型(A)、乙型(B)和丙型(C)。一直以来人们对甲型流感病毒特别是新出现的甲型流感病毒(2009H1N1、H5N1及H7N9等)的关注度远高于乙型流感。然而，虽然乙型流感病毒的抗原变异性较弱，但也常引起小规模的暴发流行[1,2]，在儿科有少数病例出现严重的临床症状，甚至死亡，因此乙型流感病毒的感染不容忽视。本课题组曾对2000至2006年北京地区儿童乙型流感的流行情况进行监测[3]，本文总结8个连续监测年度流感样儿童乙型流感病毒流行情况，并与甲型流感病毒流行特征进行比较，以期为乙型流感的防控提供数据分析。

1 方法

1.1 标本来源 首都儿科研究所附属儿童医院门诊和急诊定期收集的流感样病例全部标本。流感样病例的定义依据国家流感中心网络实验室的标准，即发热(T≥38℃)，伴咳嗽或咽痛之一者。

1.2 病毒分离 咽拭子标本经常规处理后于24 h内同时接种于传代狗肾细胞(MDCK) 和人喉癌细胞(HEP-2)，这2种细胞可分离常见的多种呼吸道病毒，利于分析乙型流感病毒与其他常见呼吸道病毒的合并感染情况。MDCK细胞行流感病毒和副流感病毒的分离，用于病毒分离的维持液含2 μg·mL-1的TPCK处理的胰酶(SIGMA公司，美国)，逐日观察细胞病变，自标本接种后第3日起每隔2 d用0.75%的豚鼠红细胞进行红细胞凝集试验。第1代病毒分离的细胞上清凝集试验阴性者行盲传培养。第2代培养仍为阴性者判定为病毒分离阴性。每份标本同时用HEP-2细胞进行呼吸道合胞病毒(RSV)和腺病毒(ADV)的分离，用于病毒分离的维持液含有2%的胎牛血清(Life Tech.公司，美国)，逐日观察细胞病变，出现病变后使用直接免疫荧光法(Diagnostic HYBRIDS公司，美国)进行鉴定。

1.3 流感病毒分离株型别鉴定 凝集试验阳性者疑为分离到流感病毒株，将培养上清以血凝滴度(++)凝集的病毒最高稀释度的倒数为一个血凝单位，制备4个血凝单位作为抗原，用血凝抑制试验鉴定流感病毒型别，包括甲1型(原季节性H1N1)、甲3型(H3N2)和乙型[B/Yamagata/16/88(B/Y)，B/Victoria/2/87(B/V)[4]]， 2009年后病毒株增加2009甲型H1N1。每个流行季使用WHO的流感诊断试剂盒(美国CDC实验室惠赠)或中国国家流感中心提供的流感诊断试剂盒中的流感病毒特异性血清进行分离株的型别鉴定。

1.4 相关说明 ①监测年度：本文共收集2006年9月至2014年5月8个连续年度流感样病例，分为8个监测年度，以2006年9月至2007年8月(2006至2007年)为1个监测年度，余7个年度类推；②北京地区9月至次年4月为流感流行季节；③年龄分组：0～6月龄、～12月龄、～3岁、～6岁、～12岁和>12岁组。

2 结果

2.1 乙型流感病毒分离阳性率 8个监测年度共有6 150份流感样病例的咽拭子标本行流感病毒检测，男3 475份(56.5%)，女2 675份，年龄3 d至16岁，平均(3.7±2.8)岁。共分离到乙型流感病毒345株(5.6%)，男194例(56.2%)，女151例，男女比例为1.3∶1。166株(48.1%)为B/V系毒株，179株(51.9%)为B/Y系毒株。其中1株B/Y系乙型流感病毒阳性标本同时分离到ADV。乙型流感病毒分离阳性的标本中，未同时分离到RSV和副流感病毒。

2.2 乙型流感病毒流行特点 如图1所示，8个流感监测年度中，共出现5个乙型流感病毒的流行高峰， 2006至2007和2007至2008年连续出现流行高峰(检出率分别为4.0%和16.8%)，之后呈现隔年出现高峰的流行趋势，分别在2009至2010、2011至2012和2013至2014年流行季出现流行高峰，病毒分离的月阳性率最高可达46.2%(2008年1月和2012年2月分别为36/78和42/91)。97.1%(335/345)的乙型流感病毒的流行都出现在北京地区的流感流行季节(9月至次年4月)，在非流感流行季节仅分离到2.9%(10/345)的乙型流感病毒。

与本实验室同期甲型流感病毒(原季节性H1N1、2009甲型H1N1、H3N2)的监测结果进行比较，2006至2007、2009至2010、2010至2011和2013至2014年，甲型流感病毒阳性率高于乙型流感病毒，且乙型流感流行高峰均出现在甲型流感流行高峰之后；在2007至2008和2011至2012年乙型流感病毒阳性率高于甲型流感病毒 ，且乙型流感流行高峰均出现在甲型流感流行高峰前。

图1 2006年9月至2014年5月乙型流感和甲型流感监测情况

Fig 1 Surveillance of influenza B and A virus infection from September 2006 to May 2014

2.3 不同谱系乙型流感病毒的流行特点 表1显示，8个监测年度中，2006至2007、2007至2008、2010至2011和2011至2012年B/V系和B/Y系乙型流感病毒同时流行，分别以B/Y-B/Y-B/Y-B/V为主要流行株；2008至2009和2012至2013年分别仅分离到3株和1株B/V系流行株；2009至2010年则以B/V系乙型流感病毒为绝对优势株，2013至2014年以B/Y系乙型流感病毒为绝对优势株。

表1显示，与WHO每年推荐的流感疫苗中乙型流感病毒型别进行比对分析，8个监测年度中，仅3个年度(2009至2010、2011至2012和2013至2014年)流感疫苗推荐的乙型流感病毒型别与本文监测到的乙型流感的流行谱系相匹配。

表1 2006至2014年8个监测年度乙型流感病毒谱系特点[n(%)]

Tab 1 Features of lineages of influenza B virus during 2006 to 2014 epidemic seasons

Notes 1) September to August of the next year. 2) The WHO recommendation of lineage within vaccines

2.4 乙型流感病毒感染患儿的年龄分布 345例乙型流感病毒阳性的患儿年龄为(4.9±2.6)岁。表2显示，～12岁组之前的5个年龄组中随着患儿年龄的增大而乙型流感阳性率逐渐增高。～12岁组感染率最高为10.8%，其次为 ～6岁组(7.0%)；除～12岁组甲、乙型流感病毒阳性率相当，余年龄组中甲型流感病毒的阳性率均高于乙型流感病毒，差异均有统计学意义。

表2 不同年龄组患儿甲型和乙型流感病毒阳性率比较[n(%)]

Tab 2 Comparison of the positive rates of Influenza A and B infection in different age groups[n(%)]

3 讨论

流感是由流感病毒引起的不仅对易感人群同时也对公共卫生有重要影响的急性呼吸道传染病。由于甲型流感的抗原易发生变异，一旦暴发流行则难以控制。特别是2009年3月，出现了猪源新的甲型H1N1流感病毒的全球暴发流行[5, 6]，随后新甲型H1N1成为主要季节性流感病毒之一；但世界各地都曾发生过以乙型流感病毒为主的流行，如1985至1986年加拿大乙型流感的暴发流行[7], 20世纪90年代日本和美国也出现了乙型流感暴发流行[8, 9]，2002年乙型流感在欧洲引起暴发流行[10, 11]。北京地区2005至2006年和2007至2008年也发生乙型流感病毒的暴发流行[12, 13]。据美国2004至2012年(不包括2009至2010年H1N1大流行)数据显示，经实验室证实的因流感死亡的儿童病例中，约37.6%为乙型流感病毒感染所致[14]。

儿童是流感病毒感染的高危人群，儿童流感一般是一个城市或地区流感流行的前哨。在流行早期，多数病例集中在儿童，特别是5～19岁人群[3,15]。3～12岁的托幼和学龄儿童，是人群聚集接触频繁群体，相互传播的概率更大，因此，成为流感病毒感染率较高的年龄组。Chan等[16]研究认为，无论是B/Y和B/V系同时流行抑或其中之一为主要流行株，中国香港地区乙型流感病毒在5～9岁和10～14岁儿童中的感染率更接近甲型流感病毒。乙型流感病毒易感儿童的年龄稍长[17]，更易引起学龄儿童的局部暴发流行，并成为社区流感流行的主要传播者[18]。本课题组曾对2000至2006年乙型流感的监测显示，乙型流感病毒阳性的患儿以门诊患儿为主，近80%为>3岁儿童[3]。本文8个年度监测结果显示，乙型流感病毒在～12岁组阳性率最高，而>12岁组阳性率下降。乙型流感病毒在～12岁组感染率与甲型流感病毒相近，而其他各年龄组甲型流感病毒的阳性率明显高于乙型流感病毒，提示乙型流感病毒在低龄儿童中的阳性率较甲型流感病毒低，在学龄儿童中易引起流行，出现一定范围的聚集发病。

1983年后乙型流感病毒逐渐演变为抗原性差异较大的2个亚系，即B/Y和B/V系[4]。本研究监测结果显示，8个监测年度2个谱系的乙型流感病毒在北京地区儿童中均有流行。流感疫苗对人体的免疫保护是否有效取决于流行株与当年流感疫苗所含组份的匹配程度。尽管WHO在推荐2012至2013年流感疫苗时，推荐使用包含2个谱系乙型流感病毒的四价疫苗，而且美国FDA已经批准了2个四价流感疫苗，但目前北京地区使用的流感疫苗是WHO推荐的北半球三价(H1、H3和B型)裂解疫苗，疫苗组份中仅包含了乙型流感病毒的一个谱系(B/Y或B/V)。当流行株与疫苗株不匹配时，疫苗提供的保护性是有限的[18]。来自美国和欧洲的监测数据显示，疫苗和主要流行的乙型流感的谱系之间的正确匹配概率仅50%[19～22]。本研究监测结果显示，在8个监测年度中，仅3个流行季流感疫苗成分与WHO乙型流感病毒流行株的谱系相匹配。因此，含有2个谱系乙型流感病毒的四价流感疫苗能提供更多的保护，起到更有效的预防作用，已有临床试验支持这个观点[23]。目前，美国CDC已经开始推荐2～8岁(可延至11岁)儿童通过鼻腔喷雾接种四价减毒流感活疫苗。

流感的流行具有明显的季节性，温带地区流感的流行高峰为每年的秋冬季，而热带和亚热带地区全年均有流感的流行，并且还会出现夏季和秋冬季2个流行高峰[24]。乙型流感通常每隔2～4年出现一次较强的流行[17]。本研究监测结果显示, 8个监测年度呈现B/Y-B/Y-B/V-B/V-B/Y-B/V-B/V-B/Y的流行趋势，大多数乙型流感病毒的流行都在冬末春初；共出现5个乙型流感病毒的流行高峰，2008年后呈现出隔年高峰的流行趋势，WHO推荐的乙型流感病毒型别与本文每年的优势流行型别匹配度不高。尽管在2009至2010、2011至2012和2013至2014年疫苗株型别与流行优势株型别一致，但仍然出现了较高的乙型流感高峰。有文献报道[25, 26]，2009至2011年北京地区B/V系乙型流感病毒的HA基因发生了改变, 表明北京地区乙型流感病毒的抗原性和基因特性发生了变异，因而引起2009至2010年乙型流感病毒的流行强度加大。推测尽管2011至2012和2013至2014年的疫苗株与主导流行株的型别一致，但仍出现了较明显的同型别乙型流感流行，可能是由于流行株出现了基因变异和抗原漂移。因此，需要加强对乙型流感病毒的基因和抗原变异的监测。

与甲型流感相比，尽管乙型流感在低龄儿童中造成的危害较轻，但其在学龄儿童中的流行同样会造成聚集发病，影响学生出勤，给社会造成一定的疾病和经济负担。乙型流感2个不同谱系同时流行，很难准确预测下一个流行季节可能成为主导流行株的型别，同时抗原漂移的不断发生，都使流感的防控面临很大的困难。因此，加强流感病原的监测，提供详实的病原学和流行病学数据，同时密切关注主导流行优势株的型别，并及时发现乙型流感病毒变异株，都将为流感防控提供科学依据。

[1]Wu JP(吴金屏), Zhao LQ, Deng J, et al. Etiological study on an outbreak of acute upper respiratory infection in children in Beijing. Chin J Epidemiol(中华流行病学杂志), 2004, 25(8):671-673

[2]Zhu RN(朱汝南), Deng J, Wang F, et al. Study on viral etiology of acute respiratory tract infections in infants and young children in Beijing area. J Clin Pediatr(中华儿科杂志), 2003, 21(1):25-28

[3]Wang F(王芳), Zhu RN, Qian Y, et al. Surveillance for influenza B virus infections in infants and young children in Beijing, China. Chin J Pediatr(中华儿科杂志), 2008, 46(2):94-97

[4]Rota PA, Wallis TR, Harmon MW, et al. Cocirculation of two distinct evolutionary lineages of influenza type B virus since 1983. Virology, 1990, 175(1):59-68

[5]Centers for Disease C, Prevention. Outbreak of swine-origin influenza A (H1N1) virus infection - Mexico, March-April 2009. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 2009, 58(17):467-470

[6]Zhu RN(朱汝南), Qian Y, Sun Y, et al. Surveillance of influenza viruses attacking children in Beijing during 2009 pandemic influenza A (H1N1). Chin J Microbiol Immunol(中华微生物学和免疫学杂志), 2010, 30(5):420-424

[7]Zou S, Prud′homme I, Weber JM. Genetic characterization of the hemagglutinin gene of influenza B virus which predominated in the 1985/86 Canadian influenza season. Can J Infect Dis, 1997, 8(5):265-269

[8]Kanegae Y, Sugita S, Endo A, et al. Evolutionary pattern of the hemagglutinin gene of influenza B viruses isolated in Japan: cocirculating lineages in the same epidemic season. J Virol, 1990, 64(6):2860-2865

[9]McCullers JA, Wang GC, He S, et al. Reassortment and insertion-deletion are strategies for the evolution of influenza B viruses in nature. J Virol, 1999, 73(9):7343-7348

[10]Ansaldi F, D′Agaro P, De Florentiis D, et al. Molecular characterization of influenza B viruses circulating in northern Italy during the 2001-2002 epidemic season. J Med Virol, 2003, 70(3):463-469

[11]Xu X, Lindstrom SE, Shaw MW, et al. Reassortment and evolution of current human influenza A and B viruses. Virus Res, 2004, 103(1-2):55-60

[12]Peng XM(彭晓旻), Wang XM, Liang HJ, et al. Influenza sureilllance and molecular characterization of influenza B viruses during 2005-2006 in Beijing. Chin J Heal Lab Tech(中国卫生检验杂志), 2007, 17(3):431-432

[13]Yang P(杨鹏), Wang QY, Shi WX, et al. Pre-warning analysis of influenza surveillance in Beijing, 2007-2008. Chin J Dis Contr Pre(中华疾病控制杂志), 2010, 14(2):108-111

[14]Wong KK, Jain S, Blanton L, et al. Influenza-associated pediatric deaths in the United States, 2004-2012. Pediatrics, 2013, 132(5):796-804

[15]Neuzil KM, Zhu Y, Griffin MR, et al. Burden of interpandemic influenza in children younger than 5 years: a 25-year prospective study. J Infect Dis, 2002, 185(2):147-152

[16]Chan PK, Chan MC, Cheung JL, et al. Influenza B lineage circulation and hospitalization rates in a subtropical city, Hong Kong, 2000-2010. Clin Infect Dis, 2013, 56(5):677-684

[17]Hite LK, Glezen WP, Demmler GJ, et al. Medically attended pediatric influenza during the resurgence of the Victoria lineage of influenza B virus. Int J Infect Dis, 2007, 11(1):40-47

[18]Paul Glezen W, Schmier JK, Kuehn CM, et al. The burden of influenza B: a structured literature review. Am J Public Health, 2013, 103(3):43-51[19]Ambrose CS, Levin MJ. The rationale for quadrivalent influenza vaccines. Hum Vaccin Immunother, 2012, 8(1):81-88

[20]Centers for Disease Control and Prevention. Seasonal influenza activity surveillance reports: 1999-2000 to 2010-2011 seasons. Available at: http://www.cdc.gov/flu/weekly/pastreports.htm. Accessed 25 Oct 2014

[21]World Health Organization. WHO/Europe influenza surveillance. Available at: http://www.flunewseurope.org. Accessed 25 Oct 2014

[22]Belshe RB. The need for quadrivalent vaccine against seasonal influenza. Vaccine, 2010, 28(S4):45-53

[23]Reed C, Meltzer MI, Finelli L, et al. Public health impact of including two lineages of influenza B in a quadrivalent seasonal influenza vaccine. Vaccine, 2012, 30(11):1993-1998

[24]Shu YL, Fang LQ, de Vlas SJ, et al. Dual seasonal patterns for influenza, China. Emerg Infect Dis, 2010, 16(4):725-726

[25]Lv YN(吕燕宁), Peng XM, Liang HJ, et al. Analysis on the characteristics of HA gene of influenza virus B circulated in Beijing area from 2009 to2010. Chin J Dis Contr Pre(中华疾病控制杂志), 2011, 15(8):689-694

[26]Hu XF(胡晓芬), Li DD, Zhang JB, et al. Analysis of HA1 gene of influenza B virus isolated in Xicheng district, Beijing. Chin J Heal Lab Tech(中国卫生检验杂志), 2012, 22(3):500-503

(本文编辑：丁俊杰)

Surveillance of influenza B virus epidemic in children with influenza-like illness in Beijing from 2006 to 2014

WANGFang,SUNYu,ZHAOLin-qing,DENGJie,TIANRun,QIANYuan,ZHURu-nan

(DepartmentofVirology,BeijingKeyLaboratoryofEtiologyofViralDiseasesinChildren,CapitalInstituteofPediatrics,Beijing100020,China)

ZHU Ru-nan，E-mail: runanzhu@163.com

ObjectiveTo investigate the prevalence of influenza B virus epidemic in children with influenza-like illness (ILL) in Beijing.MethodsThroat swabs were collected from children with ILL who visited the Children′s Hospital affiliated to Capital Institute of Pediatrics from September 2006 to May 2014. All of the clinical specimens were inoculated into MDCK cells to isolate influenza viruses and parainfluenza viruses followed by identifying different types of influenza viruses with reference antiserum by hemagglutination-inhibition assay. HEp-2 cells were used to isolate human respiratory syncytial virus and adenovirus simultaneously.ResultsOut of 6 150 throat swabs collected, 345 (5.6%) were positive for influenza B virus, of them 166 (48.1%) belonged to B/Victoria-like (B/V) lineage and 179 (51.9%) were part of B/Yamagata-like (B/Y) lineage. Throughout the eight consecutive influenza seasons, 2 lineages of influenza B co-circulating were found out in 5 seasons. Except 2006-2007 season, influenza B virus predominated every other year in the rest of seven seasons (2007-2008, 2009-2010, 2011-2012 and 2013-2014 seasons), with the highest positive rates of 46.2% in Jan. 2008 and Feb. 2012. B/V or B/Y lineage circulated with a trend of B/Y-B/Y-B/V-B/V-B/Y-B/V-B/V-B/Y, however, matching between the lineages of the influenza B strains within vaccines used and circulating lineages was achieved only in 3 influenza seasons (2009-2010, 2011-2012 and 2013-2014). Most of the activity of influenza B occurred in winter and next spring. Only a few influenza B virus strains could be isolated in non-influenza season. The epidemic peak of influenza B appeared after that of influenza A when the positive rate of influenza A was higher than that of influenza B in 2006-2007, 2009-2010 and 2010-2011, while the epidemic peak of influenza B appeared before that of influenza A when the positive rate of influenza B was higher than that of influenza A in 2007-2008 and 2011-2012. The positive rate of influenza B increased with age in children younger than 12 years old. Co-infection of influenza B with other common respiratory viruses was very rare.ConclusionInfluenza B viruses predominated in children every 2 years from September 2006 to May 2014 in Beijing. Cocirculation of B/V or B/Y lineages was found in 4 of 8 consecutive seasons which were predominated by one of lineages.

Influenza B virus; Influenza-like illness; Children; Lineage; Virus isolation

北京市科技计划：Z111107056811041；北京市卫生系统高层次卫生人才培养计划：2013-3-087

首都儿科研究所病毒研究室，儿童病毒病原学北京市重点实验室，国家级流感网络实验室 北京，100020

朱汝南，E-mail:runanzhu@163.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2015.04.004

2015-03-03

2015-05-27)