膝骨关节炎关节液和滑膜中IL-18与MMP-13的表达及临床意义

朱振标，张 寿，刘亦恒，金旭红，林之斌

(海口市人民医院骨科中心，海南 海口 570208)

膝骨关节炎关节液和滑膜中IL-18与MMP-13的表达及临床意义

朱振标，张 寿，刘亦恒，金旭红，林之斌

(海口市人民医院骨科中心，海南 海口 570208)

目的探讨膝骨关节炎(KOA)患者的关节液和滑膜中白细胞介素(IL)-18与基质金属蛋白酶(MMP)-13的表达及其临床意义。方法选取2011年1月至2013年12月期间我院收治的76例KOA患者作为观察组，76例患者中，轻度30例，中度26例，重度20例。所有受试者软骨损伤分度为Ⅱ度26例，Ⅲ度28例，Ⅳ度22例；另选择32例膝关节半月板损伤患者为对照组。检测受试者膝关节关节液、滑膜中IL-18、MMP-13表达情况。结果观察组患者的膝关节关节液和膝关节滑膜中的IL-18、MMP-13水平均高于对照组，差异均有显著统计学意义(P＜0.01)；随着KOA程度的加重，关节液和滑膜中的IL-18、MMP-13水平呈上升趋势，差异均有显著统计学意义(P＜0.01)；随着KOA分度的增加，关节液和滑膜中的IL-18、MMP-13水平呈上升趋势，差异均有显著统计学意义(P＜0.01)；关节液IL-18、MMP-13水平与滑膜IL-18、MMP-13水平分别呈正相关(r=0.361，0.371，P= 0.021，0.016)；关节液IL-18水平与关节液MMP-13水平呈正相关(r=0.369，P=0.019)；滑膜IL-18水平与滑膜MMP-13水平呈正相关(r=0.378，P=0.015)；关节液和滑膜中IL-18、MMP-13水平与KOA程度、KOA分度均呈正相关(P＜0.05)。结论MMP-13、IL-18在KOA关节液和滑膜中均高表达；两者呈现出显著正相关，共同在KOA的发病及病情进展中起作用。

骨性关节炎；白细胞介素；基质金属蛋白酶；关节液；滑膜

膝骨关节炎(Knee osteoarthritis，KOA)是骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)的一种，为一种慢性退行性骨关节病变，随着人口老龄化程度的加剧，其发病有上升趋势[1]。65岁以上人群KOA发病率高达50%以上，在美国，其发病仅次于心血管疾病，给社会及家庭带来沉重负担[2]。研究显示，细胞因子、酶类与KOA的发病关系密切，在KOA进展过程中起重要作用[3-6]。白细胞介素(Interleukin，IL)为研究较多的细胞因子，在多种炎症反应中起作用；基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)为近期研究热点之一[7]。本研究通过检测KOA关节液、滑膜中IL-18、MMP-13的水平，旨在探讨IL-18、MMP-13在膝关节KOA中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011年1月至2013年12月期间被我院骨科收治的76例KOA患者为观察组，所有患者均符合KOA的诊断标准[1]。患者年龄56～81岁，中位年龄51岁；体重指数(BMI)(22.58±3.27)kg/m2；男性36例，女性40例；左侧37例，右侧39例。依据综合ISOA及K-L放射线分级标准[1]，76例患者中，轻度30例，中度26例，重度20例。对所有受试者行关节镜检查并对软骨损伤分度[1]：Ⅱ度26例，Ⅲ度28例，Ⅳ度22例；另选择同期被我院骨科收治的32例膝关节半月板损伤患者为对照组，患者年龄57～85岁，中位年龄52岁；左侧16例，右侧16例。四组受试者的年龄、性别、吸烟状况和BMI比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表1。所有受试者均知情并签署知情同意书。本研究已通过我院伦理委员会审核批准。

表1 四组受试者的基本资料比较(±s)

表1 四组受试者的基本资料比较(±s)

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1.2 纳入排除标准

1.2.1 纳入标准[1]符合相关疾病的诊断标准；近1个月内未注射过激素类药物；无严重肝肾疾病；无其他严重脑部器质性病变；依从性佳；知情同意。

1.2.2 排除标准[1]骨肿瘤者；风湿性关节炎患者；类风湿性关节炎者；膝关节严重感染者；有其他严重精神疾病者；有酒精药物滥用史；1周内应用非甾体类药物者；不配合接受临床检查者；不愿意接受治疗者。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 于关节镜检查时收集受试者关节液、滑膜标本，术中用注射器抽取关节囊中关节液3 ml，注入离心管保存。切取关节滑膜组织放入标本袋保存。将存放关节液的离心管1 500 g/min，离心15 min，将上清液吸进EP管，于-80°C保存待测。用生理盐水多次冲洗滑膜组织，用刀片切成小块，用4%中性多聚甲醛固定，石蜡包埋待测。

1.3.2 关节液、滑膜组织IL-18、MMP-13检测采用双抗体夹心ELISA法检测关节液IL-18、MMP-13含量，试剂盒购自于上海华大科技有限公司，严格按照说明书操作[6]。滑膜标本切片行HE染色，使用免疫组化SP法检测滑膜组织IL-18、MMP-13的表达情况。采用Image Pro-Plus 6.0检测分析免疫组化结果，分析滑膜组织IL-18、MMP-13表达的积分光密度(IOD)。

1.4 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间两两比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，相关性分析采用Pearson检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受试者的关节液、滑膜中IL-18、MMP-13水平比较 观察组膝关节关节液IL-18、MMP-13水平均高于对照组，差异均有显著统计学意义(P＜0.01)；观察组膝关节滑膜IL-18、MMP-13水平均高于对照组，差异均有显著统计学意义(P＜0.01)，见表2。

表2 两组受试者的关节液、滑膜中IL-18、MMP-13水平比较(±s)

表2 两组受试者的关节液、滑膜中IL-18、MMP-13水平比较(±s)

观察组(n=76)对照组(n=32) 142.61±20.16 38.29±6.71 219.61±22.81 35.62±7.21 143.58±12.61 100.29±8.78 149.28±15.61 96.29±10.57 t值P值关节液IL-18 (pg/ml) 7.0182 0.0000关节液MMP-13 (ng/ml) 8.9639 0.0000滑膜IL-18 (IOD) 6.0872 0.0001滑膜MMP-13 (IOD) 6.8728 0.0000

2.2 四组受试者膝关节液、滑膜中IL-18、MMP-13水平 四组受试者膝关节液、滑膜IL-18、MMP-13水平比较差异有显著统计学意义(P＜0.01)；随着 KOA程度的加重，关节液IL-18、MMP-13水平呈上升趋势(P＜0.01)；随着KOA程度的加重，滑膜IL-18、MMP-13水平也呈上升趋势(P＜0.01)，见表3。

2.3 四组受试者膝关节液、滑膜中IL-18、MMP-13水平 四组受试者膝关节液、滑膜IL-18、MMP-13水平比较差异有显著统计学意义(P＜0.01)；随着KOA分度的增加，关节液IL-18、MMP-13水平呈上升趋势(P＜0.01)；随着KOA分度的增加，滑膜IL-18、MMP-13水平也呈上升趋势(P＜0.01)，见表4。

表3 四组受试者膝关节液、滑膜中IL-18、MMP-13水平比较(±s)

表3 四组受试者膝关节液、滑膜中IL-18、MMP-13水平比较(±s)

组别重度组(n=20)中度组(n=26)轻度组(n=30)对照组(n=32) F值P值关节液IL-18(ng/ml) 149.61±28.27 136.29±21.56 130.08±11.21 38.29±6.71 6.7219 0.0000关节液MMP-13(pg/ml) 287.62±35.89 201.62±29.28 181.76±12.71 35.62±7.21 7.8062 0.0000滑膜IL-18(IOD) 150.72±27.81 141.56±22.92 126.21±11.02 100.29±8.78 7.9868 0.0000滑膜MMP-13(IOD) 288.67±36.81 202.58±26.97 178.98±12.53 96.29±10.57 7.2737 0.0000

表4 四组受试者膝关节液、滑膜中IL-18、MMP-13水平比较(±s)

组别对照组(n=32)Ⅱ度(n=26)Ⅲ度(n=28)Ⅳ度(n=22) F值P值关节液IL-18(ng/ml) 38.29±6.71 128.16±9.16 135.37±20.35 152.53±29.32 6.3782 0.0000关节液MMP-13(pg/ml) 35.62±7.21 178.29±19.37 204.91±30.12 290.71±36.91 7.3721 0.0000滑膜IL-18(IOD) 100.29±8.78 125.39±9.09 142.72±23.31 152.78±27.92 7.8981 0.0000滑膜MMP-13(IOD) 96.29±10.57 176.26±4.49 201.62±26.78 292.75±36.93 7.2637 0.0000

2.4 IL-18、MMP-13与年龄、KOA程度、KOA分度、吸烟状况、BMI的相关性 对KOA关节液、滑膜中IL-18、MMP-13水平与年龄、KOA程度、KOA分度、吸烟状况、BMI等因素进行相关性分析，结果显示，关节液IL-18、MMP-13水平与滑膜IL-18、MMP-13水平分别呈正相关(r=0.361，0.371，P= 0.021，0.016)；关节液IL-18水平与关节液MMP-13水平呈正相关(r=0.369，P=0.019)；滑膜IL-18水平与滑膜MMP-13水平呈正相关(r=0.378，P=0.015)；关节液、滑膜中IL-18、MMP-13水平与KOA程度、KOA分度均呈正相关(P＜0.05)，而与年龄、吸烟状况、BMI等因素无明显相关性，见表5。

表5 IL-18、MMP-13与年龄、KOA程度、KOA分度、吸烟状况、BMI的相关性

3 讨论

KOA为退行性病变，发病原因复杂，与多种因素相关；老龄、遗传、内分泌紊乱均可引发KOA[8]。近年来大量研究发现，IL、MMP亦参与了KOA的发病，在其发病机制中起重要作用[9-15]。Ravi等[10]研究发现，和正常人群比较，IL家族在KOA患者中可异常表达。本研究显示，KOA患者关节液、滑膜中IL-18水平明显高于非KOA组患者。表明IL家族成员之一IL-18在KOA中亦起重要作用，IL-18具有促软骨细胞分解代谢的作用。研究发现IL-18可通过激活蛋白-1促进KOA滑膜增生，且IL-18表达水平与KOA严重程度相关[10]。本研究亦显示，随着KOA程度和分度的增加，滑膜IL-18、MMP-13的表达呈增强趋势。提示IL-18不仅在KOA发病中起重要作用，其表达与KOA的严重程度及病情进展亦呈现出正相关的趋势。IL-18作为精细调节因子，可促软骨细胞分解代谢，增强关节炎症、促进关节软骨退变，进而导致KOA的发病[1]。

MMP家族(MMPs)为一种重要酶类，可有效降解软骨中细胞外基质；MMP-13为MMPs一员，可对各种胶原进行有效降解，可分解胶原三螺旋结构[16]。Bozic等[4]研究发现，OA患者关节液中MMPs表达明显较正常人群不同。Hauser等[6]亦发现，OA患者滑膜中存在MMPs过量表达现象，MMPs可能在OA发病及滑膜增生过程中起重要作用。本研究通过免疫组化方法检测滑膜组织中MMP-13的表达，通过ELISA方法检测关节液中该酶类的含量，检测显示，KOA患者关节液、滑膜中MMP-13表达强度明显高于非OA者，与文献报道基本一致。提示MMP-13参与了KOA的发病，且与滑膜增生密切相关。Kneer等[1]研究发现，MMP-13在OA关节软骨损害中起一定的作用，通过免疫组化方法可以检测到MMP-13在OA组织中存在高表达现象，且MMP-13表达水平与OA严重程度相关。本研究亦显示，重度KOA患者关节液、滑膜MMP-13检测含量明显高于中度和轻度患者，随着KOA严重程度和分度的增加，关节液、滑膜MMP-13表达呈增强趋势。表明MMP-13不仅在KOA发病中起重要作用，且其表达状况与KOA的严重程度及病情进展亦呈现出明显的相关性。生理情况下MMP-13表达低，而在KOA等病理状况下，软骨细胞释放的MMP-13含量上升，可引起软骨细胞外基质降解，进而导致软骨细胞外架构受损，引起软骨细胞和软骨组织受损，软骨细胞显露于炎性环境中并进一步遭到破坏，引发KOA，其中，MMP-13的高表达在KOA的发病中起重要作用[17]。

MMPs以组织特异性的方式合成，其表达受细胞因子、激素等因素调节，MMPs在正常人群中表达极低，但在OA等病理情况下可高表达[18]。本研究中KOA关节液中MMP-13、IL-18含量明显高于对照组，且关节液中MMP-13、IL-18水平呈现出明显的正相关。在研究中我们通过免疫组化方法检测关节滑膜组织中MMP-13、IL-18的表达情况，检测结果显示，KOA滑膜组织中MMP-13、IL-18表达强度明显强于正常对照组，且滑膜组织中MMP-13、IL-18的表达之间呈现出显著正相关。表明MMP-13、IL-18两者共同参与了KOA的发病及进展，两者相互作用，导致KOA关节受损并发病，但MMP-13、IL-18调控KOA发病的具体过程仍然需要更加深入的基础研究验证。

本研究不足之处是入组对象较少、规模较小，因此在一定程度上可能影响研究的结果和精确性。因此，仍然需要更大规模的临床研究进一步验证。MMP-13、IL-18在KOA关节液、滑膜中均高表达；两者呈现出显著正相关，共同在KOA的发病及病情进展中起作用。

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Expression and clinical significance of IL-18 and MMP-13 in synovial and joint fluid in knee osteoarthritis.

ZHU Zhen-biao,ZHANG Shou,LIU Yi-heng,JIN Xu-hong,LIN Zhi-bin.
Department of Orthopaedics,Haikou People's Hospital,Haikou 570208,Hainan,CHINA

ObjectiveTo study expression and clinical significance of IL-18 and MMP-13 in synovial and joint fluid in knee osteoarthritis(KOA).MethodsFrom January 2011 to December 2011,76 patients of KOAadmitted in our hospital were selected as observation group,including 30 mild cases,26 moderate cases and 20 severe cases.According to the cartilage damage degree,the patients were divided into 26 cases ofⅡdegree,28 cases ofⅢdegree,and 22 cases ofⅣdegree.Thirty-two patients of knee joint meniscus injury were selected as the control group.The expression levels of IL-18,MMP-13 in synovial and joint fluid in knee joint of patients were tested.ResultsThe levels of IL-18, MMP-13 in synovial and joint fluid in knee joint were significantly higher in the observation group than the control group (P＜0.01).As the degree of the KOA was aggravating,IL-18,MMP-13 levels in synovial and joint fluid were on the rise, and there was statistically significant difference(P＜0.01).With the increase of KOAdividing,IL-18,MMP-13 levels in synovial and joint fluid were on the rise,and there was statistically significant difference(P＜0.01).The levels of IL-18, MMP-13 in joint fluid were positively correlated with those in synovial fluid(r=0.361,0.371,P=0.021,0.016).IL-18 level of joint fluid had positive correlation with MMP-13 level of joint fluid(r=0.369,P=0.019),and synovial IL-18 and synovial MMP-13 levels were positively related(r=0.378,P=0.378).In joint fluid,synovial IL-18,MMP-13 levels showed a positive correlation with the degree of the KOA,KOA dividing(P＜0.05).ConclusionMMP-13,IL-18 are highly expressed in the synovial and joint fluid of KOA,and there is a significant positive correlation between the two,which play a role in the pathogenesis of KOA.

Osteoarthritis;Interleukin;Matrix metalloproteinases;Joint fluid;Synovial

R684.3

A

1003—6350（2015）15—2227—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.15.0804

2014-12-11)

张 寿。E-mail：bong1976@163.com