TGF-β1促进人舌鳞状细胞癌侵袭迁移的研究

符良斌，廖天安，陈井鑫，胡广伟

(海南省人民医院口腔颌面外科，海南 海口 570311)

TGF-β1促进人舌鳞状细胞癌侵袭迁移的研究

符良斌，廖天安，陈井鑫，胡广伟

(海南省人民医院口腔颌面外科，海南 海口 570311)

目的 研究转化生长因子β1(TGF-β1)能否促进人舌鳞状细胞癌的侵袭转移。方法细胞增殖与活性实验试剂盒(CCK8)检测比较不同浓度TGF-β1刺激或不刺激舌鳞状细胞癌细胞株SCC9、CAL27之间生长速度的差异；划痕实验检测比较TGF-β1刺激或不刺激舌鳞状细胞癌SCC9、CAL27之间的迁移差异；Transwell实验进一步比较TGF-β1刺激或不刺激舌鳞状细胞癌SCC9、CAL27侵袭迁移能力的差异。结果CCK8实验表明低浓度TGF-β1刺激后SCC9、CAL27细胞与空白对照组相比活细胞数量降低，但高浓度组未明显影响舌鳞癌细胞增殖，差异具有统计学意义(P＜0.05)。划痕实验和Transwell实验均显示，TGF-β1刺激后SCC9、CAL27细胞与空白对照组相比较具有更强的侵袭能力，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。结论低浓度TGF-β1可以抑制舌鳞癌细胞的增殖，但可以显著促进舌鳞状细胞癌侵袭转移。

转化生长因子β1；舌鳞状细胞癌；侵袭迁移

舌鳞状细胞癌是最常见的口腔癌，具有极强的侵袭性和转移能力，特别是颈部转移，严重影响患者的生存质量和生存时间[1-2]。舌鳞癌主要是由鳞状上皮异常增殖形成癌变，经历从正常黏膜到白斑、原位癌、再到浸润癌的多阶段过程[3]。然而，肿瘤的侵袭转移是由多种因子相互作用引起的。转化生长因子β1(Transforming growth factor beta 1，TGF-β1)是一种具有多种生物学活性的细胞因子，能影响细胞的增殖、分化、凋亡和胞外基质产物进而调控组织的形成和分化[4]。在肺癌、肝癌等研究中已经发现，TGF-β1及其信号通路在肿瘤的发生发展过程中的作用具有双重性：在肿瘤最初发生阶段，上皮细胞对TGF-β1具有高度敏感性，TGF-β1可以抑制细胞增殖分化、诱导细胞凋亡,进而抑制肿瘤的发生发展；但在进展期，上皮细胞内TGF-β1信号通路的某些蛋白发生改变，细胞对TGF-β1的抑制作用产生耐受，反而增强肿瘤的侵袭转移能力[5-7]。然而，TGF-β1对人舌鳞状细胞癌作用的相关研究较少，本研究就重点研究TGF-β1对人舌癌细胞株SCC9和CAL27的生长、侵袭迁移能力方面的影响，为进一步探讨TGF-β1对人舌鳞状细胞癌调控的机制提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及主要试剂 舌鳞癌细胞株SCC9、CAL27购自美国菌种保藏中心(ATCC)，SCC9在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM-F12培养基中培养，CAL27在含10%FBS的高糖DMEM培养基中培养。TGF-β1购自R&D Systems公司，CCK8试剂盒购自同仁化学研究所(DOJINDO)，Matrigel胶购自BD生物技术有限公司，FBS、DMEM-F12培养基和高糖DMEM培养基均购自Gibco公司，Transwell小室、培养板和培养皿购自康宁公司(Corning)。

1.2 CCK8细胞活性实验 将人舌鳞癌细胞接种于96孔板，约5×103个/孔，实验组分别加入1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml不同浓度的TGF-β1，置培养箱内培养，1～5 d每天按分组去除96孔板每孔中培养液，每孔加入100 μl以新鲜无血清培养基稀释5倍的CCK8培养液，继续培养2 h后终止培养，在酶联免疫检测以610 nm处测量各孔的吸光值。

1.3 划痕实验 将舌鳞癌细胞种入6孔板，生长至95%左右时，用10 μl的微量加样枪头划出无细胞区，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗去划痕后脱落的细胞，拍摄划痕区0 h的图像，空白对照组以无血清培养基培养，处理组以含5 ng/ml TGF-β1无血清培养基培养，在不同时间点拍照，直至划痕区已填满，再次拍照观察细胞的迁移能力。

1.4 侵袭迁移实验 将舌鳞癌细胞胰酶消化处理后细胞计数，每个Transwell小室上室等量接种约1×105个细胞/200 μl无血清培养基，空白对照组下室加无血清培养基500 μl，处理组下室加含5 ng/ml TGF-β1培养基500 μl，37℃恒温箱培养10 h/SCC9、 24 h/CAL27后，取出小室于4%多聚甲醛固定15 min，0.1%结晶紫染色15 min，擦去小室底膜上层细胞，显微镜下计数透过膜的细胞数，随机取5个100倍视野细胞计数并取其均值。进行侵袭实验时，首先将50 μl Matrigel加入Transwell小室上室，37℃孵育30 min，然后接种细胞进行下一步实验，培养时间为20 h/SCC9、48 h/CAL27，其余同前迁移实验。

2 结果

2.1 低浓度TGF-β1抑制舌鳞癌细胞增殖 CCK8细胞活性试验显示，1～5 d后TGF-β1实验组与PBS对照组比较，1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml浓度TGF-β1组的SCC9在刺激96 h、120 h后活细胞数量明显减少[t(1ng/ml，96h)=4.512，t(1ng/ml，120h)=6.452，t(5ng/ml，96h)= 4.092，t(5ng/ml，120h)=5.636，t(5ng/ml，96h)=4.838，t(5ng/ml，120h)= 5.025，P＜0.01]，而20 ng/ml、30 ng/ml浓度TGF-β1组的SCC9活细胞数量并无明显变化[t(20ng/ml，96h)=0.942，t(20ng/ml，120h)=2.125，t(30ng/ml，96h)=2.392，t(30ng/ml，120h)=3.543，P＞0.05]；同样，1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml浓度TGF-β1组的CAL27在刺激120 h后活细胞的数量明显减少[t(1ng/ml，120h)=5.126，t(5ng/ml，120h)=6.036，t(5ng/ml，120h)=4.954，P＜0.01]，但20 ng/ml、30 ng/ml浓度TGF-β1组活细胞数量差异无统计学意义[t(20ng/ml，120h)=1.925，t(30ng/ml，120h)= 2.244，P＞0.05]，见图1，说明较低浓度的TGF-β1抑制舌鳞癌细胞的生长，较高浓度的TGF-β1并无明显影响舌鳞癌细胞的增殖能力。

2.2 TGF-β1处理的舌鳞癌细胞侵袭迁移能力增强 划痕实验显示，24 h后TGF-β1处理组的舌鳞癌细胞SCC9、CAL27均可把划过的痕全部覆盖，而PBS对照组则有明显的划痕，说明TGF-β1处理后舌鳞癌细胞的迁移能力显著提高(见图2)。Transwell实验表明，与PBS对照组的SCC9相比，TGF-β1处理的实验组SCC9细胞直接穿过Transwell小室的数量增加了5.6倍(t=5.042，P＜0.01)，而降解掉基底膜穿过Transwell小室的数量增加了6.8倍(t=6.224，P＜0.01)，见图3；经TGF-β1处理的CAL27细胞直接穿过Transwell小室的数量增加了5.8倍(t=5.804，P＜0.01)，而降解掉基底膜穿过Transwell小室的数量增加了5.2倍(t=4.684，P＜0.01)，见图3，进一步说明TGF-β1处理舌鳞癌细胞后侵袭、迁移能力显著增强。

图1 CCK8检测不同浓度TGF-β1刺激的舌鳞癌细胞SCC9、CAL27比较空白对照组细胞在不同时间点的OD比值(aP＜0.05)

图2 划痕实验检测TGF-β1刺激的舌鳞癌细胞SCC9、CAL27的迁移能力

图3 Transwell检测TGF-β1刺激的舌鳞癌细胞SCC9、CAL27的迁移及侵袭能力(×100)

3 讨论

肿瘤的侵袭转移是由多种因子相互作用后发生的。已有文献在乳腺癌、肝癌等多种实体肿瘤中证实，TGF-β1能通过β-整合素信号传导途径等多条信号通路对肿瘤发展转归发挥重要作用[8-9]。作为口腔癌中最常见的类型，舌鳞癌的预后与TGF-β1的关系也非常密切。研究表明，TGF-β1和基质金属蛋白酶-2(MMP2)在口腔鳞状细胞癌的免疫组化染色中阳性表达率明显高于正常组织，同时淋巴结转移者明显高于无转移者，说明TGF-β1与肿瘤浸润转移密切相关[10]。同时，蛋白印迹和实时定量PCR检测TGF-β1刺激或者不刺激Tca8113细胞后MTA1和E-cadherin的表达发现，TGF-β1上调MTA1的蛋白和mRNA表达，下调E-cadherin表达水平，也促进Tca8113细胞的侵袭能力，说明TGF-β1信号可以通过MTA1下调E-cadherin表达并促进舌癌的侵袭转移[11]。进一步成功构建稳定过表达转化生长因子受体1(TβR1)的UM-SCC-23细胞系后发现，MMP2表达增高的同时细胞侵袭能力增强，说明TGF-β/TβR1通路能够上调MMP2表达促进头颈鳞状细胞癌侵袭[12]。结合我们前面的划痕实验、Transwell实验发现，TGF-β1处理后舌鳞癌细胞SCC9、CAL27较空白对照组能更快的覆盖划过的痕、穿过Transwell小室。综上说明，TGF-β1处理后舌鳞癌细胞侵袭、迁移能力显著增强，TGF-β1能够促进舌鳞癌的侵袭转移。

然而增殖实验却表明，较低浓度TGF-β1(1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml)对舌鳞癌细胞SCC9、CAL27的生长增殖具有抑制作用，而较高浓度TGF-β1(20 ng/ml、30 ng/ml)并未明显影响SCC9、CAL27的增殖能力，这也进一步解释了在错综复杂的肿瘤微环境中细胞因子TGF-β1及其信号通路在肿瘤发生发展中的双重性，一方面低剂量TGF-β1可以抑制舌鳞癌的生长增殖，然而另一方面却对舌鳞癌的侵袭迁移具有显著的促进作用，说明TGF-β1的作用机制更多表现在促肿瘤的侵袭转移方面，这为以后的科学研究提供重要基础。同时也有研究发现，TGF-β1能够成功诱导CAL27以及顺铂耐药细胞株CAL27-res发生上皮间质转化，在明显增强细胞对顺铂耐药性的同时也抑制细胞增殖，促进肿瘤细胞的凋亡[13]。这进一步说明TGF-β1虽然抑制肿瘤增殖但却促进肿瘤的侵袭迁移，为我们进一步探讨TGF-β1促进舌鳞癌侵袭转移的机制提供新的思路。

总之，TGF-β1在舌鳞癌的发生发展和侵袭迁移过程中起着重要作用，可能成为新的抗肿瘤浸润转移的治疗靶点。然而，TGF-β1在促肿瘤侵袭迁移和可能发生上皮间质转换等过程的具体途径和机制需进一步实验验证，这也为我们下一步的研究提供新的思考。

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Study on TGF-β1in promoting the invasion and metastasis of human tongue squamous cell carcinoma.

FU Liang-bin, LIAO Tian-an,CHEN Jing-xin,HU Guang-wei.
Department of Oral and Maxillofacial Surgery,Hainan General Hospital,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo examine the effects of TGF-β1on invasion and metastasis in human tongue squamous cell carcinoma.MethodsCCK8 was used to detect the growth difference of human tongue squamous cell carcinoma lines SCC9 and CAL27,treated with and without different concentration of TGF-β1.Scratch healing and Transwell assay were used to detect the metastasis and invasion difference of SCC9 and CAL27 in presence and absence of TGF-β1.ResultsCCK8 showed that SCC9 and CAL27 treated with lower concentration of TGF-β1had significant reduction than untreated cells,but had no significant difference in higher concentration.Both scratch healing and Transwell assay of SCC9 and CAL27 revealed that TGF-β1-treated SCC9 and CAL27 had greater migration ability than control cells.ConclusionTGF-β1in lower concentration can suppress the proliferation of human tongue squamous cell carcinoma,but also can induce significant invasion and metastasis in human tongue squamous cell carcinoma.

TGF-β1;Tongue squamous cell carcinoma;Invasion and metastasis

R739.86

A

1003—6350（2015）15—2189—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.15.0792

2015-02-05)

符良斌。E-mail：drflb@sina.com