全自动凝胶净化-浓缩-固相萃取/气相色谱-质谱法测定紫皮石斛中有机磷农药残留

刘 超梅丽宝张绍龙张家宝谢祖宏杨 志刘芝兰

（1.保山市质量技术监督综合检测中心，云南保山678000；2.云南大学，云南昆明650091；3.武汉大学，湖北武汉430072）

全自动凝胶净化-浓缩-固相萃取/气相色谱-质谱法测定紫皮石斛中有机磷农药残留

刘 超1梅丽宝1张绍龙1张家宝1谢祖宏1杨 志2刘芝兰3

（1.保山市质量技术监督综合检测中心，云南保山678000；2.云南大学，云南昆明650091；3.武汉大学，湖北武汉430072）

建立了以凝胶渗透色谱（GPC）和固相萃取（SPE）净化、气相色谱-质谱（GC-MS）法同时测定紫皮石斛中10种有机磷农药残留的方法。样品用乙腈超声提取，提取液经GPC去除类脂杂质和大分子物质，后经Envi-Carb/NH2固相萃取柱净化，选择离子（SIM）监测模式检测，外标法定量。在26min内10种农药得到很好的分离，农药残留量在0.02～0.5μg/mL，方法的线性良好，相关系数为0.997 3～0.999 9，农药加标浓度为0.05mg/kg和0.2mg/kg时，加标回收率在70.4%～115.8%，相对标准偏差在2.8%～9.6%，满足国家标准要求，检出限为0.005 2～0.011mg/kg。方法简便、快速、灵敏、准确，能够运用于石斛中多组分有机磷农药残留的定性和定量分析。

凝胶渗透色谱；固相萃取；气相色谱-质谱法；紫皮石斛；有机磷农药

0 前言

石斛属（Dendrobium）是兰科植物中第二大属，全世界约有1 400种，我国约有76种，具有“益胃生津、滋阴清热”的功效［1-4］，作为“食药同源、以食为主、开发多元、前景广阔”的农副、林业和生物药用资源产品，越来越受到消费者的青睐和追捧。为了提高病虫害的防治效果，农药已广泛应用于石斛生产种植中，从而引起石斛农残超标，并且随着人们对食品安全重视的不断提高，加强石斛及其产品中农药残留的检测和控制已成为社会发展的需要。

目前对中草药等保健食品的农残检测已有相关报道［5-8］，但针对石斛农残的检测方法报道较少［9］。本文根据国家农残限量［10］和当地石斛有机磷农药使用情况，采用全自动凝胶净化-浓缩-固相萃取法和气相色谱-质谱联用技术，建立了同时测定石斛中敌敌畏、甲拌磷、乐果等10种有机磷农药残留量的方法。该方法简便、快速、灵敏、准确，能够运用于石斛中多组分有机磷农药残留的定性和定量分析。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent科技有限公司）：7890A-5975C，配有电子轰击离子源（EI）；HP-5毛细管色谱柱（30m×0.320μm×0.2μm，美国Agilent科技有限公司）；PrepElite-Gvs全自动凝胶净化-浓缩-固相萃取系统（美国Labtech有限公司）；Bio-Beads SX3凝胶色谱柱（20mm×300mm i.d，美国Labtech有限公司）；MS205DΜ电子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；AS3120超声仪（北京华瑞博远科技发展有限公司）；RE-3000旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

农药标准物质：敌敌畏、甲拌磷、乐果、毒死蜱、倍硫磷、马拉硫磷、杀螟硫磷、对硫磷、喹硫磷、三唑磷购于农业部环境保护科研检测所，浓度均为100μg/mL。

环己烷、乙腈、丙酮为色谱纯，购自美国Supelco公司；乙酸乙酯（优级纯，天津市光复精细化工研究所）；氯化钠、无水硫酸钠为分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司；无水硫酸钠在650℃下灼烧4h，置于干燥器中备用。Carb/NH2固相萃取小柱（500mg/6mL，美国Agilent科技有限公司）。

除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为二次去离子水。

紫皮石斛样品采自云南省龙陵县龙山镇。

1.2 实验过程

1.2.1 混合标准溶液的配制

以丙酮为溶剂，依次吸取上述10种农药标准溶液各500μL于50mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，制成浓度为1.0μg/mL的标准溶液，然后逐级稀释，配制成浓度为0.02，0.08，0.16，0.32，0.5μg/mL的标准工作溶液。

1.2.2 试样的提取

将石斛鲜条切碎，放入样品粉碎机中搅碎，制成试样。称取10.0g搅碎的样品，置于100mL具塞三角锥形瓶中，加入50mL乙腈，超声提取45min（每5min震摇一次），然后用滤纸将滤液过滤到预先装有5g氯化钠的50mL具塞量筒中，收集滤液40mL，盖上塞子，激烈震荡1min，静置，使乙腈和水相分层，然后吸取20.0mL乙腈溶液于50mL圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪上减压蒸发近干，加入5.0mL环己烷∶乙酸乙酯（1∶1）溶解，待净化。

1.2.3 样品的净化

将预先用丙酮淋洗过的Carb/NH2固相萃取小柱安装于固相萃取装置中，把上述浓缩液转移至全自动凝胶净化-浓缩-固相萃取系统的样品瓶中，按照1.3.1设定的条件进行净化，最后过0.22μm的有机滤膜，滤液供GC-MS分析。

1.2.4 测定

待仪器稳定后，在选定的仪器操作条件下，依次准确吸取1.0μL标准溶液（或处理后的样品溶液）注入GC-MS仪中，以保留时间和离子丰度比定性，以单离子外标法定量。

1.3 实验条件

1.3.1 全自动凝胶净化-浓缩-固相萃取条件

GPC条件：用环己烷∶乙酸乙酯（1∶1）作为流动相，柱温40℃，进样量2mL，流速4mL/min，检测波长254nm，定时收集5～15min洗脱液。

第一次浓缩条件：加热温度50℃，氮吹时间20min，蒸干时间1min，消雾时间0.5min，置换溶剂丙酮，定容体积2.0mL。

SPE条件：洗脱溶剂丙酮，注入体积10.0mL，流速3.0mL/min。

第二次浓缩条件：加热温度50℃，氮吹时间10min，蒸干时间1min，消雾时间0.5min，置换溶剂丙酮，定容体积2.0mL。

1.3.2 气相色谱-质谱（GC-MS）条件

2 结果和讨论

2.1 提取溶剂的确定

根据有关方法［11-12］以及相关文献［13-15］报道，农残检测使用较多的提取溶剂有乙酸乙酯、石油醚、丙酮等。通过实验研究，丙酮作为提取溶剂时，样品中溶出的色素和杂质多，乙腈提取时，溶出的杂质少、后处理简便，因此，实验采用乙腈作为提取溶剂。

2.2 凝胶色谱条件的确定

凝胶渗透色谱是依据样品分子量大小进行分离，色素、多糖等分子量大的物质先流出色谱柱，分子量小的农药后流出色谱柱。吸取1.0μg/mL的农药混合标准溶液注入色谱仪，用环己烷∶乙酸乙酯（1∶1）洗脱，根据紫外色谱图的变化情况，分段收集流出液，进行GC-MS定性检测，确定收集时间。

2.3 质谱条件的优化

通过全扫描（SCAN）获得混合标准物质的总离子流图（TIC），根据总离子流图中目标化合物的保留时间和质荷比（m/z），确定选择离子扫描（SIM）模式下的分析条件。10种有机磷农药的保留时间、定量离子、定性离子及丰度比见表1。

2.4 校准曲线及其相关性

按照实验所确定的分析条件，10种有机磷农药得到了很好的分离（见图1）。同时以色谱峰的保留时间和离子相对丰度比与标准样品一致程度来进行定性确证，相对丰度比大于50%时，允许偏差±10%；相对丰度比范围在20%～50%时，允许偏差±15%；相对丰度比范围在10%～20%时，允许偏差±20%；相对丰度比小于10%时，允许偏差±50%。定量测定时，以农药的浓度（C，μg/mL）为横坐标，选择离子峰面积（A）为纵坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程和相关系数，结果表明，10种农药在0.02～0.5μg/mL浓度范围内线性关系良好，其相关系数均大于0.997，结果详见表1。

表1 10种有机磷农药的保留时间、定量和定性离子等相关参数Table 1 Retention times，quantitative ions and qualitative ions，of 10organophosphorous pesticides

2.5 方法的加标回收和精密度实验

在紫皮石斛空白样品中分别添加0.05mg/kg和0.2mg/kg的混合有机磷农药标准溶液，按实验方法提取、净化，每一水平平行测定6次，获得的选择离子流色谱图按信噪比3倍（S/N＝3）条件计算方法的检出限，实验结果表明：在0.05和0.2mg/kg的添加水平，10种有机磷农药的平均加标回收率在70.4%～115.8%，相对标准偏差为2.8%～9.6%，符合国家标准要求，检出限为0.005 2～0.011mg/kg。详见表2。

图1 10种有机磷农药标准溶液（0.4μg/mL）选择离子流色谱图Figure 1 SIM chromatogram of 10organophosphorous pesticides standards.

表2 0.05mg/kg和0.2mg/kg加标水平下10种有机磷农药的回收率、精密度和检出限Table 2 Recoveries，precisions and detection limits of 10organophosphorous pesticides at 0.05mg/kg and 0.2mg/kg spiked levels（n＝6）

2.6 实际样品的分析

运用建立的方法对采集的20份紫皮石斛样品进行分析检测，其中2份样品检出毒死蜱，1份样品检出杀螟硫磷，其余样品均未检出上述农药。

3 结语

实验建立了全自动凝胶净化-浓缩-固相萃取/气相色谱-质谱法测定紫皮石斛中10种有机磷农药残留的方法。该方法操作简单、快速，测定结果准确、可靠，能够运用于石斛中多组分有机磷农药残留的定性和定量分析。

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Determination of Organophosphorous Pesticide Residues in Dendrobium Devoninum Paxt Using Automatic Gel Permeation Chromatography and Solid Phase Extraction by Gas Chromatography-Mass Spectrometry

LIU Chao1，MEI Libao1，ZHANG Shaolong1，ZHANG Jiabao1，XIE Zuhong1，YANG Zhi2，LIU Zhilan3
（1.BaoshanComprehensiveInspectionCentreofQualityandTechnicalSupervision，Baoshan，Yunnan678000，China；2.YunnanUniversity，Kunming，Yunnan650091，China；3.WuhanUniversity，Wuhan，Hubei430072，China）

A novel method has been developed for simultaneous determination of ten organophosphorous pesticide residues in Dendrobium Devoninum Paxt based on automatic gel permeation chromatography（GPC）coupled with solid phase extraction（SPE）-gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）.The sample was extracted with acetonitrile by ultrasonic extraction.The automatic gel permeation chromatography was used to remove the macromolecule interference material and fat，and then the pigment in the extraction solution was purified by Envi-Carb/NH2solid phase extraction.The qualitative analysis was performed by using mass spectrometric detection in the selected ion-monitoring（SIM）mode under the optimal chromatographic conditions.The external standard method was adopted for quantitative analysis.Ten organophosphorous pesticides were separated from each other within 26minutes，A good linearity was in the range of 0.02～0.5μg/mL with correlation coefficients of 0.997 3～0.999 9.The recoveries ofpesticides at spiked levels of 0.05and 0.2mg/kg were 70.4%～115.8%.The detection limits were 0.005 2～0.011mg/kg with therelative standard deviations（RSDs）of less than 16%.The method is rapid，accurate and sensitive，and can meet the demand of determining organophosphorous pesticide residues in Dendrobium.

gel permeation chromatography（GPC）；solid phase extraction（SPE）；gas chromatographymass spectrometry（GC-MS）；Dendrobium Devoninum Paxt；organophosphorous pesticides

O657.63；TH843

A

2095-1035（2015）04-0008-05

2015-04-29

2015-07-01

云南省保山市科技计划项目（2015025）资助

刘超，男，助理工程师，主要从事产品质量检验研究。E-mail：chaoliu2003＠163.com

10.3969/j.issn.2095-1035.2015.04.003