preS/S 区基因变异与隐匿性HBV 感染的关系▲

景媛媛 段 勇 郭 燕

(陕西省西安市中心血站检验科，西安市 710061，E－mail:jingyuanyuantg@163.com)

隐匿性HBV 感染(occult hepatitis B virus infection，OBI)指患者HBV 标志物HBsAg 及HBeAg 阴性或抗－HBs与抗－HBc 阳性，血清中可检测到低水平HBV－DNA 或肝组织检测出HBsAg 或HBcAg。传统的慢性HBV 感染是通过检测血清中HBsAg 确定诊断。目前越来越多研究表明，无论是急性自限性肝炎，还是成功进行抗HBV 治疗后慢性乙型肝炎患者，HBsAg 清除后部分患者肝组织中仍可检出HBV DNA，肝脏损害依然存在(多为慢性严重肝损伤)，仍可发展为肝硬化或肝癌［1－4］。早在20 年前就有人发现血清中含抗－HBs 的供血者能传播HBV 感染，特别是仅抗－HBc 阳性的传播可能性更大［5］。因此隐匿性HBV的感染机制是近年来此类疾病的研究热点。有研究表明在HBV Pre－s/s 区域的任何突变均可改变HBsAg 的抗原性和抑制抗－HBs 的产生［6］。在s 区域的124 ～147 氨基酸序列包含了“α”决定子和一个应答抗－HBs 的显性B 细胞抗原簇［7］。单个氨基酸在这个区域的替换可间接破坏抗－HBs的循环产生，导致在接种疫苗或隐匿性HBV 感染后发生变异性感染［8－9］。有人发现氨基酸第129 位天门冬氨酸和第145 位丙氨酸置换可导致血循环中HBsAg 阴性;s 蛋白第122 与123 位之间、123 与124 位之间，分别有2 ～3 个氨基酸插入，也可导致HBsAg 不能检出［10－12］。本文通过对HBsAg 阴性患者及HBsAg 阳性患者的血清进行DNA 提取及分析，探讨了HBV preS/S 区基因变异与OBI及肝脏损伤的关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择我单位2014 年1 ～12 月116 例HBsAg 阴性患者(为乙型肝炎康复患者)及102 例HBsAg阳性患者。HBsAg 阴性患者中男67 例，女49 例，年龄23 ～69(43.2±5.1)岁;HBsAg 阳性患者中男66例，女36 例，年龄20 ～71(41.9±4.3)岁。根据美国创伤外科协会(American Association of the Surgery of Trauma，AAST)分级标准［8］对两组患者肝损伤程度进行分级，在一级以上均定义为肝损伤，一级至三级定义为慢性肝损伤，三级以上(不包括三级)为严重肝损伤。HBsAg 阳性患者伴严重肝损伤共73 例，HBsAg 阴性患者伴严重肝损伤38 例，其中后者肝损伤多为慢性严重肝损伤。两组患者的性别、年龄等数据比较，差异无统计学意义(P ＞0.05)，具有可比性。所有患者均在知情情况下参与此次研究，并已签署知情同意书。

1.2 主要仪器及试剂 HBV－DNA 荧光定量检测试剂盒(德国凯杰公司，批号:51306);LightCycler480 荧光定量PCR 仪［罗氏诊断产品(上海)有限公司］。

1.3 HBV－DNA 提取与定量检测 两组患者均于清晨空腹肘静脉采集血液3 ml，3 000 r/min 离心10 min 后取上清液至于－20℃待检。使用HBV－DNA 荧光定量检测试剂盒进行DNA 的提取:取样本血清置入试管，使用一步法在血清中加入核算释放剂后全部转入扩增，50℃反应2 min，于94℃保温5 min 后再按94℃15 s、57℃30 s进行45 个循环;使用LightCycler480 荧光定量PCR 仪进行定量检测，敏感性设定为500 IU/ML。

1.4 PCR 扩增HBV 核酸检测 对116 例HBsAg 阴性患者的DNA 进行PCR 扩增HBV 核酸检测，依照文献［13］的方法进行引物的设计，分别针对preS/S 区、pre－core/core区及X 基因区的巢式PCR 反应体系对OBI进行检测。使用MBI Frematas Taq 在PCR 仪上进行扩增，具体方法如下:第一轮总体系10 μl，双蒸水5.0 μl，缓冲液1.0 μl，镁离子1.0 μl，Dntp 0.8 μl，两侧引物各0.05 μl，Taq 酶0.2 μl，DNA 模板1 μl。循环条件为预变性94℃、5 min，变性94℃、30 s，退火56℃、30 s，延伸72℃、30 s，进行30 个循环;第二轮其他条件不变，循环增加至40 个。DNA 样本以出现两个或两个以上片段的特异性扩增产物为OBI 基因组阳性。

1.5 HBV preS/S 区全长基因进行测序分析 查照HBV 参考序列，使用Primer Premier5 进行分析后设计一条正向引物(P1，5'－TTCTTGGGAACAAGAGCTAC－3')，两条反向引物(R1，5'－GCAAAGCCCAAAAGACCCAGAAT－3';R2，5'－TGACAATACTTTCCAATCAAT－3')。两 对 引 物 扩增片段分别为1410 bp 和1383 bp。扩增产物在理论上已经包含了HBV preS/S 区基因。使用PCR 仪进行扩增，将产物过琼脂糖凝胶电泳后进行纯化回收，进行检序，无法直接检序的在产物末端加A 尾后连接T 载体，检测结果使用SciEd7 软件进行分析。分别比较OBI 患者与HBsAg 阳性患者、伴有严重肝损伤的OBI 患者与HBsAg 阳性患者的preS/S 区基因序列突变或缺失情况。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0 软件进行统计分析，计量资料以表示，组间对比采用t 检验，计数资料采用χ2检验，以P ＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 PCR 扩增HBV 核酸检测结果 对116 例HBsAg阴性患者的DNA 进行PCR 扩增HBV 核酸检测，出现preS/S 区、pre－core/core 区、X 基因区的例数分别为49、64、27，HBV DNA 阳性者70 例，最终OBI 检出率(即HBV－DNA 阳性率)为60.34%(70/116)，其中男性48例，女性22 例，伴有严重肝损伤患者38 例。

2.2 preS/S 区全长基因进行测序分析结果

2.2.1 OBI 患者与HBsAg 阳性患者的preS/S 区基因序列比较:OBI 患者M1I、Q2K、Q129N/R/P、S210R 及G185R的突变频率均明显高于HBsAg 阳性患者(P ＜0.05)，OBI患者的preS 缺失率也高于HBsAg 阳性患者(P ＜0.05)。见表1。

表1 OBI 患者与HBsAg 阳性患者preS/S 区基因序列突变或缺失比较(n，%)

2.2.2 伴有严重肝损伤的OBI 患者与HBsAg 阳性患者的preS/S 区基因序列比较:两者Q129N/R/P 突变频率及preS 缺失率比较，差异无统计学意义(P ＞0.05)，伴有严重肝损伤的OBI 患者M1I、Q2K、S210R 及G185R 突变频率均明显高于HBsAg 阳性患者(P ＜0.05)。见表2。

表2 伴有严重肝损伤的OBI 患者与HBsAg阳性患者的preS/S 区基因序列突变或缺失比较(n，%)

3 讨 论

OBI 的发生是病毒和机体相互作用的结果，其可能有多种发病机制:(1)HBV 低水平复制，抗原表达量低;(2)HBV 基因变异;(3)HBV 整合到宿主染色体中;(4)外周血单核细胞感染HBV;(5)宿主免疫应答异常;(6)受其他病毒感染的干扰;(7)试剂的灵敏度和质量问题。OBI 普遍存在，其意义有下面几个方面:(1)输血、血液透析以及脏器移植传播HBV 的潜在危险。(2)隐源性肝病的病因。(3)OBI 病情恶化已有诸多报道，但发生频率尚不清楚。(4)在肝细胞癌病人中常常发现OBI 的存在，认为与原发性肝癌发生有关，尤其是合并丙肝病毒感染时。(5)当丙肝病毒感染合并OBI时，将会影响其自然病程或增加疾病的严重程度。(6)乙肝疫苗接种无应答的原因之一。此外HBV 隐匿性感染者是HBV 母婴传播途径的重要传染源［14－16］。

本研究对大量临床实例的血液DNA 样本进行监测，探讨了HBV preS/S 区基因变异与OBI 及肝脏损伤的关系，结果显示OBI 患者M1I、Q2K、Q129N/R/P、S210R 及G185R 的突变频率均明显高于HBsAg 阳性患者(P ＜0.05)，OBI 患者的preS 缺失发生率亦高于HBsAg阳性患者(P ＜0.05);提示OBI 患者与HBsAg 阳性患者在基因层面上的发病机制有着较大的不同，M1I、Q2K、Q129N/R/P、S210R 及G185R 的突变及preS 缺失对OBI 的诊断有一定的指导帮助。伴有严重肝损伤的OBI患者Q129N/R/P 突变率及preS 缺失率与HBsAg 阳性伴严重肝损伤的患者比较，差异无统计学意义(P ＞0.05)，但M1I、Q2K、S210R 及G185R 突变频率均明显高于均明显高于HBsAg 阳性伴严重肝损伤的患者(P ＜0.05)，提示以上preS/S 区基因序列的突变对评价OBI 患者的肝损伤有一定的指导作用，但当患者存在肝损伤时Q129N/R/P变异及preS 缺失对OBI 的诊断作用可能受到影响。

综上所述，OBI 与HBsAg 阳性患者之间导致慢性严重肝损伤的病毒学因素不同，M1I、Q2K、S210R 及G185R 等突变对于OBI 患者而言可能是评价其是否可能发展为慢性严重肝损伤的重要指标，同时从另一方面说明了对HBsAg 阴性人群进行HBV－DNA 检测的必要性。

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