首次利用液相阻断E L I S A检测口蹄疫O型抗体的试验报告

张作秀

（格尔木市动物疫病预防控制中心，青海 格尔木 816099）

酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种常用的固相酶免疫测定方法,是在放射免疫分析理论的基础上发展起来的一种非放射性标记免疫技术,具有灵敏度高、特异性强、重复性好 ,所用试剂稳定、易保存,试验操作简便,结果判断客观等特点[1]。液相阻断ELISA用于检测家畜血清中的口蹄疫(FMD)抗体。主要应用于两个方面:一是检测FMD病毒感染,广泛用于国际贸易中；二是监测免疫抗体,评价FMD疫苗免疫效果,也就是疫苗免疫动物的抗强毒攻击能力[2]。液相阻断ELISA试验操作虽比正向间接血凝试验(PHA)繁琐,但它的精确性、稳定性远远高于正向间接血凝试验[1]。

笔者首次利用液相阻断ELISA试验检测牛羊O型口蹄疫免疫效果，检测牛45头份，羊45只份，现将检测结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 检测样品

1.1.1 郭勒木德镇的拖拉海村和阿拉尔生态畜牧业合作社分别无菌采集牛血45份，羊血45份，共计牛90份，羊90份。

1.1.2 倾斜试管静止24h，待血清自然析出，分装、标记、冷藏保存运送至实验室。

1.2 器材准备

1.2.1 移液器。0.2～10 uL、5～50 uL、50～200 uL、50～300uL12道移液器各一把；U型微量血凝板18块。

1.2.2 纯水仪制作纯净水。

1.3 试剂

1.3.1 从2℃～8℃冰箱取出口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒回归室温（20℃～25℃）30 min。该试剂盒由青海省动物疫病预防控制中心提供，中国农业科学院兰州兽医研究所生产，有效期为 6 个月，批号：2014120901-3。

1.3.2 将本试剂盒配备的25倍PBST浓缩液用纯净水稀释成1倍PBST：按1∶25倍稀释（1份浓缩液加入24份纯净水进行稀释）。

1.3.3 底物溶液的配制。取一片柠檬酸-磷酸盐片剂溶于100mL纯净水中，溶化后，取50mL本溶液，再加一片邻苯二胺（OPD）片剂，充分溶解，分装，避光，临用前加每1mL底物溶液加10uL3%双氧水。

2 操作方法

2.1 抗原抗体反应

在U型反应板上，A1-A10孔每孔加75 uL的1xPBST和25uL被检血清，以50uL/孔的量稀释至1∶512；在A11孔加 50uL1xPBST和50uL标准阳性血清，以50uL/孔的量稀释至1∶1 024；A12孔和B12孔稀释阴性对照血清，从1∶2稀释至1∶4；E12-H12孔为病毒抗原对照。

2.2 加病毒抗原

将病毒抗原用1xPBST稀释至1∶5的工作浓度，以50uL/孔量加入到被检血清、阴阳性对照的每一个孔中，4孔病毒抗原对照仅加入100uL/孔稀释好的病毒抗原。每孔加入50uL病毒抗原，封板，振荡，置4℃冰箱过夜。

2.3 移板

将抗原抗体混合液从U型板上按次序以50uL/孔的量移至已包被口蹄疫O型兔抗的ELISA板上，封板，37℃温育60min。

2.4 加豚鼠抗体工作液

洗板5次，甩干，以50uL/孔加口蹄疫O型豚鼠抗体工作液，封板，置37℃温箱温育30min。

2.5 加兔抗豚鼠IgG-HRP工作液

洗板5次，甩干，以50 uL/孔加兔抗豚鼠IgGHRP工作液，封板，置37℃温箱温育30min.

2.6 加底物溶液

洗板5次，直接加底物溶液每孔50uL（加底物溶液之前，按1mL底物溶液加10uL3%双氧水），37℃温箱温育15min。

2.7 加终止液

每孔直接加50 uL终止液，置酶标仪上读取OD492nm值。

3 结果判定

3.1 判定试验是否成立

设立的4孔病毒抗原对照OD492nm值均在1.0～2.0内；阳性对照效价在1∶1024滴度以内；阴性对照抗体效价＜1∶8。故而本次试验成立。

3.2 判定被检血清抗体效价

病毒抗原4孔，弃去最高和最低OD492nm值，剩余2孔的平均值除以2，即为50%对照值，该值就表示阻断50%反应的对照OD492nm值即临界值。被检血清的OD492nm值大于临界值的孔为阴性孔，小于等于临界值的孔为阳性孔。若临界值与稀释倍数最高阳性孔的OD492nm值相同，则以被检血清阳性孔的最高稀释倍数作为该份血清的抗体效价；若临界值处于两个孔之间，抗体效价取上下两孔稀释倍数的反对数中间值。

3.3 判定检测结果

被检血清抗体效价大于或等于1∶128判为口蹄疫O型抗体阳性；小于1∶128判为抗体效价阴性[1]。据统计共检测牛血清45份，抗体阳性34份，阳性（合格）率75.6%；检测羊血清45份，抗体阳性42份，阳性（合格）率93.3%。

4 结果分析

此次引用液相阻断ELISA试验检测牛羊O型口蹄疫免疫抗体各45份，抗体效价均达到农业部规定的标准（群体抗体效价70%）。抽检样品的群体均在2014年10月份注射过口蹄疫双价苗，截止液相阻断ELISA试验操作虽比正向间接血凝试验(PHA)繁琐,但它的精确性、稳定性远远高于正向间接血凝试验[2]。在操作中几个关键点把握不好,也会导致实验结果发生偏差或试验失败,笔者简要介绍液相阻断ELISA操作中的几点注意事项。

5 小结

5.1 试剂的回温及室温孵育试剂盒中所有试剂,包括包被反应板,在使用之前恢复至室温(20℃～25℃),特别是冬季气温较低,充分的回温尤为重要。室温孵育时,控制室温在 20℃～25℃,避免在冷气、光照、热源或通风口等温度不均匀的位置进行检测,注意不要把反应板直接放在冰冷的实验桌面上,可以垫上东西作为缓冲[3]。

5.2 反应时间每次加样最好按统一顺序加,计时要准确。反应板多时，要记得依次加样。

[1]马军武,刘湘涛,胡弘博，等.液相阻断ELISA检测口蹄疫病毒抗体方法的建立[C].中国畜牧兽医学会第九次全国口蹄疫学术研讨会论文集.兰州：中国畜牧兽医学会口蹄疫分会,2003，364～368.

[2]马军武,林密,祁淑芸.检测口蹄疫Asia-Ⅰ型病毒抗体液相阻断ELISA的特异性和敏感性[C].中国畜牧兽医学会第九次全国口蹄疫学术研讨会论文集.兰州：中国畜牧兽医学会口蹄疫分会,2005，378～380.

[3]刘颖，冉多良，王香祖.O型口蹄疫疫苗免疫家畜抗体水平的检测[J].动物医学进展，2008（10）.