采用冷冻干燥工艺制备地区性凝血因子室间调查品的初步研究

宋颖，戴菁，王青，丁秋兰，王学锋

(1.上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海200025;2.上海市临床检验中心，上海200126)

采用冷冻干燥工艺制备地区性凝血因子室间调查品的初步研究

宋颖1，戴菁1，王青2，丁秋兰1，王学锋1

(1.上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海200025;2.上海市临床检验中心，上海200126)

目的采用冷冻干燥工艺制备血浆凝血因子室间调查品。方法对新鲜血浆进行处理加入冻干保护剂，分装后冷冻干燥，使其符合《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》(CNAS－GL03)的要求。将自制的凝血因子调查品分别发至医院进行凝血因子测定。结果采用筛选试验和正交实验，得到的冻干保护剂的最佳配方为海藻糖(1.5%)、甘氨酸(0.5%)、4－羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，0.2%);分装精度为每瓶的平均分装值为0.569 9 g，范围从0.564 6 g～0.576 7 g，s为0.003 5 g且变异系数(CV)为0.61%。自制冻干品的平均含水量为1.22%，s为0.197%，CV为16%。均匀性采用两种方法评估:(1)F检验:F值为0.06;(2)T检验:P=0.053，所以均匀性符合CNAS－GL03要求;稳定性采用|－|≤0.3σ，即差值的绝对值为0.07＜界值1.702符合GL03要求。采用自制冻干品进行室间调查，凝血因子Ⅷ结果为自制冻干品CV%分别为21.3、16.6、25.8(与卫生部临床检验中心的调查结果类似)。结论自制凝血因子的室间调查品可以满足地区性质量控制计划的需要。

凝血因子Ⅷ;冻干品;室间调查品

国际公认的血友病患病率在1/5 000男性，据此估计我国血友病患者人数约为14万人左右，而目前登记在册的血友病患者不足一成，说明多数血友病患者没有得到正确诊断[1]。血友病患者进行正确的诊断，除了临床表现外，实验室检查特别是凝血因子活性的检测是疾病诊断的重要依据。

在上海地区已有多家三级医院开展血友病甲的凝血因子Ⅷ检测工作，卫生部临床检验中心和上海市临床检验中心于2014年分别开展了凝血因子的室间质评计划[2]。但所采用的室间调查品均为进口商品质控品，由于价格昂贵、浓度水平单一，无法满足室间质评的需要。我们采用冷冻干燥技术处理新鲜血浆，制备凝血因子室间调查品，并在上海地区开展凝血因子室间调查活动。

材料和方法

一、材料和仪器

所用试剂和仪器分别见表1和表2。

二、方法

1.血浆选择和处理献浆员经测试乙肝表面抗原、丙肝抗体和人类免疫缺陷病毒－1(HIV－1)抗体检测均阴性。制备的室间调查品凝血因子Ⅷ包括低、中和高3个浓度水平。凝血因子血浆的制备方法:抗凝剂为枸橼酸盐、磷酸盐、葡萄糖和腺嘌呤(CPD－A)，抗凝剂与血浆比例为36 mL∶200 mL，血液以1 200×g离心15 min，分离上层液体至三联袋中得到血浆，在22℃条件下以2 300×g离心10 min(每单位血浆加入冻干保护剂，然后以相同条件离心后待用，经检测凝血因子浓度约为40%～100%，可作为高浓度凝血因子血浆[3]。(1)低浓度凝血因子血浆的制备方法:血浆中加入硫酸钡(BaSO4)与血浆比率为1∶7(w/v)(BaSO4需经121℃高压灭菌15 min)，加入后在混匀器上混匀30 min。以2 300×g离心10 min。取上清液，即为凝血因子含量低浓度的血浆;(2)中浓度凝血因子血浆的制备方法:将低浓度凝血因子血浆与未处理的原液按一定比例稀释，可得到凝血因子Ⅷ浓度为7%～50%的各浓度血浆。配制后的血浆浓度与预期浓度比较，用回归方程统计，并用配对t检验统计配制结果是否符合预期)。

2.冻干保护剂配方为提高冻干制品的稳定性，在冻干前需在血浆中加入一定配方的冻干保护剂。(1)初筛实验:实验采用HEPES、甘氨酸、PEG、海藻糖按不同的配比分成10个组别，添加入血浆后在相同的真空压力下进行冷冻干燥[4]，测定PT和APTT结果，通过APTT、PT、Fbg变化情况、冻干品外观两个方面选择冻干前、后样本测定值变化最小，且冻干品外观最佳的保护剂[5];(2)冻干保护剂配方的优化:采用正交试验设计的方式[6]，该设计是研究多因素多水平的一种设计方法，根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的9点进行试验，通过这9个点的检测结果，并按一定的统计分析方法，以获取最佳配比组合。

计算极差R值，R值为最好平均试验结果与最差平均试验结果的差值，反映此因素对于考察指标的影响程度。差值最大的因素为最主要的因素，依次类推，从而得到最佳的海藻糖、甘氨酸和HEPES组合。

3.血浆分装由于冻干品是采用冷冻干燥技术将原有液态样本进行冷冻干燥处理使其成为固态，使用时将冻干品中加入定量的液体，复溶成液态样品。因此，对分装的样本量有精度要求。本实验采用IBS公司的Dose－it 803分装仪对血浆进行分装，并在分装的过程中抽取一定比例的样本(每5支抽取1支)，共抽取10支，用称重法得到分装前、后样本的重量，两者重量相减即为分装的样本量，计算后得到分装精度。评价方法采用样本加入量的平均值(s)和变异系数(CV%)。分装精度与欧洲凝血因子Ⅷ标准品分装精度相比较[3]。

4.样本冻干过程将在－40℃低温冰箱中预冻过夜的样本，快速放入Christ冻干机按既定程序完成冷冻干燥过程，具体步骤包括:启动冻干机，预冷至－60℃放入制品，在此温度下进行升华干燥，持续时间约为6 h;提升隔板温度进行解析干燥，持续时间为20 h。冻干完成后加盖放入4℃保存。

5.凝血因子冻干品性能评估对制备的室间调查品的性能进行评估，其中均匀性和稳定性应符合《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》(CNAS－GL03)要求[7]。此外，冻干品的含水量应符合《中国药典》的要求[8]。

6.组织初步调查将制备的冻干血浆调查品发放至上海5家临床实验室进行凝血因子活性的实验室间评价。

结果

一、不同浓度凝血因子Ⅷ的配制效果

采用回归分析方法，将各浓度梯度调查品的测定值与预期值进行比较，绘制预期值与实测值的关系图(图1)，计算回归方程及r2值分别为Y =0.977 5X+0.747 8，r2值为0.995 2。凝血因子Ⅷ%实测值与预期值作配对t检验，结果差异无统计学意义(P值为0.330，P＞0.05)。

二、冻干保护剂筛选试验

初筛试验和配方优化试验，结果见表3～6。

其中，A组为2.5 mg/mL氨基酸;B组为5 mg/mL甘氨酸;C组为10 mg/mL甘氨酸;D组为5 mg/mL HEPES;E组为10 mg/mL HEPES; F组为2.5 mg/mL PEG;G组为2.5 mg/mL PEG; H组为2.5 mg/mL海藻糖;I组为2.5 mg/mL海藻糖;J组为未加保护剂。

按原定方案选择冻干前、后差异较小，冻干外观较佳的为B、D、E、H组成分作为冻干保护剂的主要成分。

K1为每列中所有“1”序列之和，K2为每列中所有“2”序列之和，K3为每列中所有“3”序列之和;k1=K1/3，k2=K2/3，k3=K3/3;R值为极差值，为每列中最大值与最小值的插值，R值最大为因素1，R值最小为因素3，因素1＞因素2＞因素3。据此得出，海藻糖为主要因素，对每个因素的k3最大，所以最佳配方是海藻糖(1.5%)、甘氨酸(0.5%)和HEPES(0.2%)。血浆中加入此配方的保护剂，冻干后凝血Ⅷ%的回收率能达到100%左右。

三、分装精度的评价

结果见表7。统计得到分装精度为每瓶的平均分装值为0.569 9 g(扣除试管本身重量)，范围为0.564 6～0.576 7 g，s为0.003 5 g，CV为0.61%，与欧洲凝血因子Ⅷ标准品分装精度CV为0.61%相一致。

四、调查品评估

1.均匀性和稳定性用同质性检验证明样本一致性程度，由于凝血因子Ⅷ%一期法检测是基于APTT实验的，所获得的凝血因子Ⅷ%测定值为通过定标曲线折算后的结果，所以同质性检验以APTT秒数为基准。以冻干前、后APTT测定值(秒数)的平均数计算均匀性和稳定性结果，见表8。

2.样本含水量应用Karl Fischer滴定分析法测定冻干样本的含水量。按《中国药典》规定，凝血因子Ⅷ冻干品的含水量应小于3%，我们自制冻干品平均含水量为1.22%，s为0.197%，CV为16%，符合要求。

五、实验室室间调查

采用自制质控品水平1、水平2、水平3，结果见表9。

讨论

上海地区目前多家三级医院开展凝血因子检测项目。上海市临床检验中心对凝血项目的开展情况进行了一次调查，发现凝血项目检测(包括凝血因子)普遍存在的问题:(1)试剂批号更换频繁:检测人员无法独立完成定标操作，主要依靠厂商的技术员。每次检测前未进行定标操作;(2)定标方法错误:未采用实测法获得定标曲线;(3)实验室未参加室间质评计划，无法评价不同实验室检测结果之间的一致性。为此，开展凝血因子室间调查非常有必要。

通过我们的研究表明，凝血因子的均匀性和稳定性符合《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》的要求，室间调查结果显示，自制凝血因子冻干品和商品化的质控品在所调查的5家医院实验室结果间CV%分别为:水平1(21.3%)，水平2(16.6%)，水平3(25.8%)，与卫生部临床检验中心的调查结果(CV约20%)比较接近，所以自制凝血因子调查品的测定结果也部分反映实验室的实际检测水平。

凝血因子检测项目的逐步开展，凝血因子检测的规范化也随之完善，世界血友病联盟(WFH)也对凝血因子的实验室检测提出规范化要求。在上海，开展凝血因子检测项目的实验室远低于国外的实验室，凝血因子的检测方法绝大多数实验室仍然局限于一期法。使用高敏试剂的实验室数量极少。每批凝血因子项目检测进行重新定标的实验室也很少。这种情况与国外实验室的因子检测水平相比存在较大差距。2002年已经颁布WS/T 220－2002《中华人民共和国卫生行业标准凝血因子活性测定总则》。

此次制备的凝血因子调查品缺乏溯源性，调查没有采用经赋值的冻干品。对于某个室间调查项目，参加实验室少于10家的情况下，由于所采用的检测系统不同，无法将所有实验室的检测结果相加求平均值，造成所有检测结果未达到统计学最少例数，降低了统计结果的可靠性。这种情况下可由两种解决方法:(1)采用经赋值的冻干调查品进行室间调查，即将已赋值的调查品发放至各实验室进行室间调查，将回馈结果与赋值结果相比较，得到反馈报告;(2)增加调查实验室的个数，达到统计学要求。

不同国家和地区相继建立自身的凝血因子检测的标准品体系。中检院虽然凝血因子Ⅷ标准品出售，但价格昂贵，缺乏临床使用价值。临床上使用最多的还是商品化的标准血浆，由于每个系统所用标准血浆不同，检测结果的可比性存在一定差异。文献表明凝血因子检测的最主要的影响因素是标准品存在差异。此外，上海市临床检验中心的主要职能就是帮助各医院实验室操作者掌握标准的操作规范，为此我们实验室应该为需要的实验室提供技术支持。并且作为世界卫生组织(WHO)试剂合作中心，我们应加强与WHO在Shefield的凝血总部合作，研制出一种可以溯源至国内甚至国际标准品的比对物质，然后将冻干品发放给各医院的实验室，与临床样本同步检测，这样可以提高检测的可靠性。同时也为临床实验室节约成本支出。

[1]丁秋兰，王学锋，王鸿利，等.血友病诊断和治疗的专家共识[J].临床血液学杂志，2010，24(1):49－53.

[2]成斐，王学锋，周文宾，等.凝血因子Ⅷ和Ⅸ实验室检测现状调查与分析[J].中华检验医学杂志，2014，37(3):203－206.

[3]BARROWCLIFFE TW，HUBBARD A，WELLER L，et al.The certification of a European reference plasma for factorⅧ:BCR－629[M].Luxembourg:Office for Official Publications of the European Communities，2004.

[4]BAKALTCHEVA I，O'SULLIVAN AM，HMEL P，et al.Freeze－dried whole plasma:evaluating sucrose，trehalose，sorbitol，mannitol and glycine as stabilizers[J].Thromb Res，2007，120(1):105－116.

[5]姚静，张自强.药物冻干制剂技术的设计及应用[M].北京:中国医药科技出版社:2007，232－234.

[6]陈志翔，屈荣华，李培朵，等.复方板蓝根颗粒沸腾制粒干燥工艺研究[J].中国药业，2009，18(4):42.

[7]CNAS－GL03:2006.能力验证样品均匀性和稳定性评价指南[S].

[8]王箐舟，赵卉，王威，等.第四批人凝血因子Ⅷ国家标准品制备和标定[J].中国药品标准，2013，14(3):188－190.

Primary research on freeze drying technology for the preparation of coagulation factor external quality control material in local area

SONG Ying1，DAI Jing1，WANG Qing2，DING Qiulan1，WANG Xuefeng1.(1.Ruijin Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200025，China;2.Shanghai Center for Clinical Laboratory，Shanghai 200126，China)

ObjectiveTo use freeze drying technology for preparing plasma coagulation factor external quality control material，in order to use it into local quality control scheme.MethodsFresh plasma was treated with freeze drying protective agent.Filling the plasma in vials，Germany Christ freeze dryer was used to lyophilize the plasma.The self－made materials were prepared，which should meet the requirements of Guidance on Evaluating the Homogeneity and Stability of Samples Used for Proficiency Testing(CNAS－GL03).The materials were deliveried into several hospitals for the determination of coagulation factor.ResultsBy screening tests and orthogonal experiments，the optimum freeze drying protective agent's formula was trehalose(1.5%)，glycine(0.5%)and HEPES(0.2%).The average packing bottle precision value was 0.569 9 g(net weight)，ranging from 0.564 6 g to 0.576 7 g，S was 0.003 5 g，and coefficient of variation(CV)was 0.61%.The average moisture of self－made lyophilized product was 1.22%，S was 0.197%，and CV was 16%.Homogeneity testing used 2 methods to evaluate(1)F test:F=0.06;(2)T test:P= 0.053 so the homogeneity met the requirements of CNAS－GL03.The stability testing used|－|≤0.3σ，and the absolute value of difference was 0.07，which was＜critical value 1.702，which met the CNAS－GL03 requirements.By using self－made lyophilized product in external quality control survey，the results of coagulation factorⅧCV%were 21.3，16.6 and 25.8(the results were similar to those of the National Center for Clinical Laboratory).ConclusionsThe self－made coagulation factor external quality control material can meet the requirements of external quality control scheme in local area.

Coagulation factorⅧ;Lyophilized product;External quality control material

1673－8640(2015)03－0269－05

R446.1

A

10.3969/j.issn.1673－8640.2015.03.017

2014－07－09)

(本文编辑:储怡星)

宋颖，女，1977年生，学士，副主任技师，主要从事临床血液体液检测工作。

王学锋;联系电话:021－64232858。