荧光定量PCR定量检测5种假丝酵母菌方法的建立

夏乾峰，傅琼瑶，邬强，覃西，姚茂忠，黄绵庆，邢桂兰，钱士匀

(1.海南海医药物安全性评价研究有限责任公司，海南海口570102; 2.海南医学院热带医学与检验医学院，海南海口570102)

荧光定量PCR定量检测5种假丝酵母菌方法的建立

夏乾峰1，傅琼瑶2，邬强2，覃西1，姚茂忠1，黄绵庆1，邢桂兰1，钱士匀1

(1.海南海医药物安全性评价研究有限责任公司，海南海口570102; 2.海南医学院热带医学与检验医学院，海南海口570102)

目的建立并评价从血液标本中检测5种假丝酵母菌的荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法。方法以5种假丝酵母菌共有的高度保守序列为靶序列，设计特异引物和探针进行检测，优化定量PCR体系，并进行方法学评价。结果建立的荧光定量PCR方法，其线性范围为101～109CFU/mL;灵敏度为5 CFU/mL;批内和批间CV值均＜5%;对19份模拟血液标本进行检测，其中分别含有5种假丝酵母菌的标本均为阳性，而分别含有常见血液感染曲霉菌和细菌的检测结果均为阴性。结论建立的检测血中假丝酵母菌荧光定量PCR方法快速、准确，结果可靠，可对常见的临床血液感染假丝酵母菌进行定量检测。

假丝酵母菌;实时PCR;定量

随着广谱抗菌药物、免疫抑制剂等的广泛使用，以及介入治疗的大量开展，侵袭性真菌感染(invasive fungal infection，IFI)逐年增多，其发病率和死亡率居高不下。IFI已成为影响人类生活质量、威胁生命健康的重要疾病之一[1]。白假丝酵母菌是IFI最重要的致病菌，但近年来临床分离的非白假丝酵母珠菌显著增多，如光滑假丝酵母、热带假丝酵母、克柔假丝酵母和近平滑假丝酵母。

由于IFI大多发生在有严重基础疾病的患者中，病死率高，假丝酵母病病死率可达40%[2]。两个独立研究团队发现，IFI的死亡率与抗真菌治疗时机有重大关系，48 h后对患者进行抗真菌治疗的死亡率比12 h内采取抗真菌治疗高25%，而血液培养阳性率18 h内仅为9%，24 h内为23%[3－4]。建立快速检测真菌的方法，早期获取检测结果可指导临床及时采取适当治疗方案，将大大降低患者的死亡率[5]。然而，培养法耗时长且不够敏感，常常延误诊断和治疗，而且有45%～70%的播散性假丝酵母病和几乎全部的IA的血培养结果都是阴性[6];绝大多数IFI患者无特异的临床表现，只能根据临床经验或典型的影像学表现进行判断，很难与其它疾病区分，这就决定了该类疾病抗真菌治疗绝大多数是经验性治疗[7]。尽管传统真菌镜检、培养以及组织学检查仍然是诊断真菌病的金标准，但非培养方法因其高度敏感和特异性在真菌病的诊断上日益成为重要的工具。

实时聚合酶链反应(PCR)因其信号检测与PCR扩增同管、同步进行，属于均相测定，故可减少污染，操作简化，并且可自动化完成扩增及定量检测[8]。我们通过生物信息学方法确定5种假丝酵母菌共同保守序列，设计特异性引物和荧光探针，建立检测5种假丝酵母菌的实时PCR方法，并进行了方法学评价。

材料和方法

一、材料

1.菌株来源白假丝酵母菌(ATTCC 10231)、近平滑假丝酵母菌(ATTCC 22019)热带假丝酵母菌(C2f)、光滑假丝酵母菌(C6e)及克柔假丝酵母菌(C6a)由国家医学真菌保藏中心提供。常见的血液感染病原菌为海南医学院附属医院检验科微生物室临床分离保存，包括:烟曲霉菌、黄曲霉菌、土曲霉菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、沙门菌、阴沟肠杆菌。

2.仪器与试剂引物和探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;Fastfire qPCR PreMix(Probe)反应试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;真菌基因组DNA提取试剂盒为北京索莱宝科技有限公司生产;沙保弱培养基、血平板均由海南医学院病原生物学实验室配制。Mx3005P QPCR System荧光定量PCR仪由美国Agilent公司生产;电泳成像系统为Tanon 1600成像系统。

二、方法

1.标准品DNA的制备将培养好的白假丝酵母菌加入生理盐水中混匀，采用牛鲍计数板计数，计算出菌液浓度，进行10倍梯度稀释得6个浓度的标准品103～108CFU/mL。真菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，保存于－20℃。

2.引物探针的设计在NCBI的Gen Bank数据库获取5种假丝酵母菌的5.8srRNA、28srRNA基因、ITS区的DNA序列分别为:C.albicans (AM998790)、C.dubliniensis(FN178506)、C.tropicalis (AB437044)、C.parapsilosis(GU373657)、C.glabrata (AM492797)和C.krusei(AY235807)。Alignment在线工具对各病原体靶基因核苷酸序列进行多序列比较、分析，寻找出适合设计引物和探针的核苷酸序列区域。采用计算机软件PRIMER EXPRESS 2.0，以白假丝酵母菌靶基因(基因序列号，AM998790)进行引物和探针设计，引物和探针须为5种酵母菌的共同序列;探针的5'端标记FAM荧光报告基团，3'端标记非荧光的淬灭基团BHQ1。P1:5'－CAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGC－3';P2:5'－GGGCGCAATGTGCGTTCAA－3';probe: FAM－5'ATCGATGAGAACGCAGCGAATGCGATA3'－BHQ1。PCR产物长度为113 bp，引物和探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成及标记。

3.荧光定量PCR体系的建立选用20 μL反应体系，模板用量2 μL，Fastfire qPCR PreMix (Probe)13 μL，10 μmol/L引物各1 μL，10 μmol/L探针0.5 μL。反应条件:50℃2 min，95℃2 min; 95℃15 s，58℃35 s，共40个循环。在扩增结束后按同一条件分析数据，确定各样品的阈值循环数(threshold cycle，Ct)。

4.方法学评价根据标准曲线，维持相关系数(r)在0.99以上，判断方法的线性范围。对高浓度(1.0×106CFU/mL)和低浓度(1.0× 103CFU/mL)阳性的样品重复做5个平行管，定量结果计算CV值，判断批内重复性;相同的样品重复检测5次，重复检测5次，定量结果计算CV值，判断批间重复性。将DNA模板以10倍连续稀释至1 CFU/mL，用ddH2O做阴性对照，进行荧光定量PCR，能区别于阴性对照的最低浓度即为该法的灵敏度。对常见的血液感染致病微生物进行检测，鉴定其特异性。

5.模拟临床标本检测将100 μL浓度为104CFU/mL菌液的白假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌及克柔假丝酵母菌分别种植于健康体检者1 mL血液中，提取总DNA后，采用本法检测。

结果

一、标准曲线的建立

将白假丝酵母菌标准品DNA进行10倍梯度稀释得6个浓度的标准品:103～108CFU/mL，分别以每个浓度标准品作为模板进行荧光定量检测，所得荧光曲线经软件处理自动获得标准曲线，见图1。

二、方法学评价

1.线性范围当白假丝酵母菌DNA倍比稀释度在101～109CFU/mL时，有很好的线性关系，相关系数为0.997。

2.灵敏度将能扩出目的片段、出现典型S型曲线的最低浓度定为检出限，本法的检出限为5 CFU/mL。

3.重复性分别对高、低浓度样品进行批内和批间重复性测定，结果低浓度样品的批内重复性CV为4.32%，批间CV为4.87%;高浓度样品的批内CV为3.12%，批间CV为3.58%，两者CV值均＜5%。

4.特异性对多种常见血液感染曲霉菌和细菌进行检测，未发现阳性结果，证明本法特异性强。

5.模拟标本检测模拟白假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌及克柔假丝酵母菌血液感染的标本均能够用本法检出。

讨论

荧光定量PCR分为染料法和探针法两类。染料法利用游离DNA染料不发射荧光，而一旦与双链DNA结合后，荧光值大大增强的原理，其优势在于能够监测任何双链DNA，只需设计普通引物，不必设计探针，使检测方法简化，成本低;但也正是由于染料能够与任何双链DNA结合，因此其也能和非特异性产物如引物二聚体、非特异扩增产物、双链模板等结合，产生非特异荧光信号，降低了特异性，故不适于临床检测[9]。探针法包括TaqMan探针、蝎型探针、分子信标等。这些探针均是在与模板互补的同一寡核苷酸链上，分别标记荧光基团和淬灭基团，每一次扩增中通过水解或者杂交等方式破坏两者之间的荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)，从而发出与扩增产物等量的荧光信号，故其特异性高，定量准确，因而被广泛应用于科研和临床诊断中[10]。

近年来，敏感、特异的早期快速诊断方法用于真菌诊断研究的报道逐渐增多。包括免疫学技术检测体液、组织中的真菌抗原(包括葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质、脂类、黑色素)或抗体;分子生物学技术用于真菌的检测对某些深部真菌病的早期诊断具有重要价值[11]。分子生物学技术主要采用真菌核糖体RNA基因(rDNA)片段作为靶基因。真菌核糖体的基因包括4种，25S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA。它们在染色体上头尾相连、串联排列，相互之间由间隔区分隔。间隔区是位于核糖体大小亚基基因之间的核苷酸序列，因其具有一定种间特异性和种内保守性而被作为种间鉴定的靶点。我们通过对5种假丝酵母菌的rDNA片段进行多序列比较、分析，获得保守序列，并通过BLAST比对，设计出特异的PCR引物和探针。该法能够检测出模拟血液感染的5种假丝酵母菌的标准菌株，并且和常见的临床血液感染曲霉菌和细菌无交叉反应，有较好的准确性和特异性。

本研究所建立的实时荧光定量PCR方法可对5种假丝酵母菌进行准确定量，为临床血液假丝酵母菌感染提供了快速、准确的方法。

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(本文编辑:范基农)

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《检验医学》编辑部

Establishment of fluorescence quantitation PCR for the quantitative detection of five species of Candida

XIA Qianfeng1，FU Qiongyao1，WU Qiang1，QIN Xi1，YAO Maozhong1，HUANG Mianqing1，XING Guilan1，QIAN Shiyun2.(1.Research for Drug Safety Evaluation of Hainan Province，Hainan Haikou，China;2.The Faculty of Laboratory Medicine and Tropical Medicine，Hainan Medical College，Hainan Haikou 570102，China)

ObjectiveTo establish and evaluate fluorescence quantitation polymerase chain reaction(PCR)for the quantitative detection of 5 species of Candida.MethodsThe presence of DNA from pathogens in the Candida species was detected by the PCR targeting internal transcribed spacer region of fungal gene.The PCR was optimized and evaluated methodologically.ResultsThe fluorescence quantitation PCR showed a wide range of linearity from 101－109CFU/mL，high sensitivity 5 CFU/mL，within－run and between－run coefficients of variation(CV)＜5%.When the PCR was applied directly to identify 19 mocked double－blind blood samples，5 of them were positive to 5 species of Candida，and the other 14 of them were negative to other pathogens.ConclusionsThe PCR may be appropriate for clinical laboratories as accurate，rapid and reliable determination for the most frequently encountered Candida species.

Candida;Fluorescence quantitation polymerase chain reaction;Quantitation

1673－8640(2015)03－0265－04

Q503

A

10.3969/j.issn.1673－8640.2015.03.016

2014－10－20)

海南省自然科学基金项目(813187);海口市重点科技计划项目(2012－063)

夏乾峰，1979年生，博士，教授，从事临床微生物学检验教学和科研工作。

钱士匀，联系电话:0898－66893746。