两组中药方剂对糖尿病足产ESBLs大肠埃希菌和MRSA体外药物敏感性试验结果分析

梁晓谊，朱海英，刘笑梅，潘敏

(华佗医院检验科，广东肇庆526040)

两组中药方剂对糖尿病足产ESBLs大肠埃希菌和MRSA体外药物敏感性试验结果分析

梁晓谊，朱海英，刘笑梅，潘敏

(华佗医院检验科，广东肇庆526040)

目的了解黄连液和黄连液联合麝香2组方剂对糖尿病足常见多重耐药菌——产超广谱β－内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抑菌和治疗效果。方法收集确诊为糖尿病足的患者，经细菌培养分离出病原菌138株，筛选出其中的产ESBLs大肠埃希菌和MRSA共67株，运用琼脂稀释法检测中药组方一(黄连液)及组方二(黄连液联合麝香)对2种病原菌的最小抑菌浓度(MIC)。同时观察2组方剂对糖尿病足的治疗效果。结果组方一对35株产ESBLs大肠埃希菌的MIC≥128 mg/mL，而组方二其MIC值下降至32 mg/mL，组方二的MIC值范围为32～128 mg/mL。32株MRSA的MIC值也从组方一的32 mg/mL降至组方二的8 mg/mL。经比较发现，加入麝香的组方二对2种细菌的MIC值较组方一下降明显，并且疗效显著，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论用中药组方黄连液联合麝香对糖尿病足常见的病原菌——产ESBLs大肠埃希菌和MRSA具有显著的抑菌作用，这为今后的临床治疗提供了一种新的方法。

中药敏感性试验;超广谱β－内酰胺酶;大肠埃希菌;耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;黄连液;麝香;糖尿病足

糖尿病足是常见的糖尿病慢性并发症之一，可引起足部溃疡、感染、坏疽，严重时可致截肢[1]。目前西医的治疗方法主要是清创和控制感染，但由于大量广谱抗菌药物的滥用，引起了正常菌群失调和耐药菌株的产生。根据徐灵芝等[2]的研究表明，糖尿病足的致病菌主要是大肠埃希菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、假单胞菌等。尤其对于产超广谱β－内酰胺酶(extendedspectrum beta lactamase，ESBLs)大肠埃希菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin－resistant Staphylococcus aureus，MRSA)所引起的感染常呈现出复杂性、难治性等特点，给临床治疗造成了较大的困难[3]。大量的临床资料显示，中医药治疗糖尿病足副作用小[4]，华佗医院采用中药方剂黄连液外敷治疗糖尿病足也取得了良好的效果，现在原有的基础组方上增加单味麝香，新组方显示出更有效的抑菌作用，可加速溃疡面的愈合。为128/3、64/3、32/3、16/3、8/3、4/3、2/3、1/3、0.5/3、0.25/3 mg/mL。

4.菌液制备菌种复苏，传代培养。用接种环挑取4～5个菌落接种于水解酪蛋白胨肉汤中，35℃2～8 h，用生理盐水校正菌液浓度至0.5麦氏比浊标准。

二、方法

1.琼脂稀释法将2组含不同浓度抗菌药物的琼脂平板和一个不含药物作空白对照用的琼脂平板的底部分别用笔画出放射状小格并编号。吸取制备好的菌液1～2 mL点种于含药琼脂平板表面相应的小格内，每点菌落数约1×104cfu，形成直径5～8 mm的菌斑。置35℃18～24 h观察结果。一个平板接种12个菌株，可同时测定12个菌株的最低抑菌浓度(minimun inhibitory concentration，MIC)。

2.多重耐药菌及筛选标准多重耐药菌主要是指对临床使用的三类或三类以上抗菌药物同时呈现耐药的细菌[6]。根据美国临床实验室标准化协会(ClinicalandLaboratoryStandards Institute，CLSI)抗菌药物敏感性试验标准[7]进行筛选，采用琼脂稀释法检测苯唑西林MIC＜2 μg/mL的金黄色葡萄球菌判定为MRSA;采用肉汤稀释法检测头孢噻肟或头孢他啶加入4 μg/mL克拉维酸后MIC比单药降低3个倍比稀释度以上视为菌株产ESBLs。

3.治疗方法对照组用熬制的复方黄连液原液充分浸泡溃疡面20 min，浸泡完毕用渗透黄连液的无菌纱布覆盖固定;观察组浸泡完毕后用无菌纱布拭干，在创面上均匀涂布已溶解的麝香粉剂(0.2 g/支)，再盖上无菌纱布，胶布固定，每2天换药1次，4周后作疗效评定。

4.疗效标准参照1997年卫生部制定的《中药新药临床研究指导原则》[8]。临床治愈:局部肿胀消失，皮肤颜色复常，溃疡面完全愈合;显效:局部肿胀及皮肤颜色明显改善，溃疡面缩小70%以上;有效:局部肿胀及皮肤颜色明显改善，溃疡面缩小30%以上;无效:达不到有效指标。

三、统计学方法

用SPSS 13.0统计软件进行分析，对计数资料的对比采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

材料和方法

一、材料

1.菌株来源收集华佗医院2012年3月至2013年4月间住院治疗的糖尿病足患者，年龄43～76岁。取足部溃疡、腐烂标本经细菌培养、鉴定为细菌性感染的病原菌138株，再从中筛选出MRSA32株，产ESBLs大肠埃希菌35株，共67例作为疗效观察组，剩下71例作为疗效对照组。各菌株固体琼脂穿刺培养，石腊封存。质控菌株为大肠埃希菌(ATCC 25922)和金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)。

2.中药药液的制备由华佗医院制剂室中药师配制。所有中药均购自广东和翔中药饮片厂。组方一:黄连液提取液2 000 mL，该处方是由黄柏、黄连、黄芩、栀子等组成，每种中药准确称量后用蒸馏水浸泡30 min，加热煮沸后改文火熬30 min，过滤取汁，药渣再加入蒸馏水同法煎熬20 min，通过充分煎煮，使药物中的有效成分完全析出，过滤后两汁液混合煎至浓缩成1∶1液，成流浸膏剂，即每1毫升药液相当于1 g原生药[5]，用2.5 mol/L NaOH校正pH值至7.2。组方二:溶解1 g麝香备用，黄连液提取液2 000 mL。

3.中药琼脂平板的制备将抗菌药物原液进行浓度递减稀释，稀释后的药物浓度分别为1 280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5 mg/mL，分装成2组试管，每组30管，并在第2组试管中每管加入相当于30 mg麝香溶解物，充分混匀。然后以1∶9的比例将已倍比稀释的不同浓度药液加入水解酪蛋白胨琼脂中，充分混匀后倾入无菌平皿中，此时第1组含药琼脂的含药浓度为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL，第2组

结果

一、体外药物敏感性试验

用琼脂稀释法测定2组中药方剂对产ESBLs大肠埃希菌和MRSA的MIC值，结果判定以试验菌株在最低浓度时即被抑制表示对该组方敏感。试验结果显示，组方一对ESBLs大肠埃希菌和MRSA的MIC值分别为128和32 mg/mL，组方二的MIC值分别为32/3和8/3 mg/mL，2种细菌均在增加麝香的组方二中比组方一有更大的抑菌作用。

二、疗效观察

两组患者通过对比研究，观察治疗组的临床疗效明显优于对照组，差异有统计学意义(χ2= 13.73，P＜0.005)。见表3。

讨论

随着临床上抗菌药物的不合理使用，耐药菌株不断增加和播散，抗菌药物的耐药状况日趋严峻，特别是对产ESBLs的革兰阴性杆菌，它不仅能分解第1、2代头孢菌素，而且能分解广谱头孢菌素和单酰胺类抗菌药物，增加了临床感染性疾病的治疗难度。而MRSA更是呈现多重耐药性，耐药率已超过50%[9]。对于糖尿病足患者因全身抵抗力低下和足部组织坏死因素等，感染了多重耐药菌后更难以控制。

在抗菌药物选择压力增大的情况下，中药有着与抗菌药物不同的作用机制，而且它们的抑菌作用同细菌的特性无关，这是中药不同于西药的独到之处。华佗医院早于1995年开始利用中药泡洗和外敷，通过热和药的双重作用治疗糖尿病足、褥疮等，取得良好的效果[10]。本研究组方一中的黄连液处方是由黄柏、黄连、黄芩、栀子等中药组成，此方具有清温热、除燥湿、泻火、解毒的功效，对患者进行疗效观察，治愈率达26.8%，总有效率达69.0%。随着细菌的不断变异，特别是多重耐药菌的感染正呈逐年递增的趋势[11]，在耐药性不断增加的压力下，我们在原有的基础组方上加入麝香，麝香有开经络、辟恶气、杀虫、解毒的功效，可治疗一切癥瘕疮痈，在治疗效果上比组方一更胜一筹，治愈率为40.3%，总有效率更达91.0%。从试验结果中我们可以看到中药组方黄连液联合麝香对糖尿病足的常见病原菌有着明显的抑制作用。与组方一相比，组方二加入麝香后对2种细菌的MIC都有明显的下降。对于产ESBLs大肠埃希菌，MIC由原来的128 mg/mL降至32/3 mg/mL，在此浓度下，菌株受到明显的抑制;同样，MRSA的MIC也由32 mg/mL下降至8/3 mg/mL，使试验菌株的生长得到进一步抑制，这为临床的药效评估提供了合适的浓度和剂量参考。本试验结果表明，黄连液联合麝香比原组方的抑菌作用明显增强，为临床治疗糖尿病足提供了一种新的有效方法。对于那些抗菌药物无效的多重耐药菌，中药将成为控制感染的另一选择。但由于现阶段中药的体外药物敏感性试验(琼脂稀释法)操作比较繁琐，缺少完整的检测方法和判断标准。期待不久的将来中药也有自己标准的体外药物敏感性试验方法和判断标准。

[1]龚岚.黄莲与冰绷散治疗糖尿病足溃疡的效果观察[J].护理学报，2010，17(12):62－63.

[2]徐灵芝，杨叶虹，叶红英，等.糖尿病足感染的细菌学特点与预后分析[J].浙江临床医学，2008，10 (4):451－452.

[3]董春雷，朱长太.医院分离病原菌分布及药物敏感性分析[J].检验医学，2011，26(10):658－661.

[4]卢雯玲，刘铜华.中医药防治糖尿病足的研究进展[J].中国现代中药，2006，18(10):25－28.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:工业出版社，2005:679.

[6]中华人民共和国卫生部.多重耐药菌医院感染预防控制技术指南(试行)[S].卫办医改发[2011]5号，卫生部，2011.

[7]Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standerds for antimicrobial susceptibility testing; Twenty－second informational supplement[S].M100－S22，CLSI，2012.

[8]中华人民共和国卫生部.中药新药临床研究指导原则[M].3版.北京:人民卫生出版社，1997:30.

[9]倪语星，尚红，刘运德，等.临床微生物学检验[M].5版.北京:人民卫生出版社，2012:4.

[10]李碧娟，胡娟娟，刘燕媚，等.中药泡足治疗糖尿病足的效果观察[J].护理学报，2009，16(2):63－64.

[11]李继霞，公衍文.多重耐药菌医院感染状况分析[J].检验医学，2013，28(9):784－788.

(本文编辑:姜敏)

2015年《检验医学》开设继续教育项目的通知

为满足全国检验医学工作者，尤其是基层和地处偏僻地区的医学检验工作者对继续教育的需求，充实基础理论知识、促进检验医学水平、提高教学和科研质量，节省有关检验医学工作者接受继续教育的费用和时间，在本刊编委专家们的积极支持下，经国家继续教育委员会批准，本刊于2004年起每年开设继续教育(Ⅰ类学分)栏目，内容涉及临床检验和血液学检验、免疫学检验、微生物学检验、生物化学检验、分子生物学检验、实验室管理等检验医学领域的新技术、新进展。自开设继续教育栏目以来，各地学员踊跃报名，反应热烈。2015年本刊将继续申办继续教育(Ⅰ类学分)，欲参加者请关注本刊，具体事宜可与本刊编辑部联系。

本刊地址:上海市洪山路528号《检验医学》编辑部;邮编:200126;电话:(021)68316211、68316300－1102;传真:(021)68315766。网址:http://www.shjyyx.com;Email:shjyyxzz@126.com。

Analysis on the in vitro susceptibility test results from two groups of traditional Chinese medicine prescriptions for diabetic foot producing ESBLs Escherichia coli and MRSA

LIANG Xiaoyi，ZHU Haiying，LIU Xiaomei，PAN Min.(Department of Clinical Laboratory，Huatuo Hospital，Guangdong Zhaoqing 526040，China)

ObjectiveTo understand the inhibitory and treatment effects of Coptis chinensis and Coptis chinensis with Musk prescriptions for diabetic foot producing extended－spectrum beta lactamase(ESBLs)Escherichia coli and methicillin－resistant Staphylococcus aureus(MRSA).MethodsThe patients diagnosed as diabetic foot were enrolled.After culturing，138 isolates of bacteria were isolated，and 67 isolates of ESBLs Escherichia coli and MRSA were screened.The minimum inhibitory concentrations(MIC)of Coptis chinensis(prescription 1)and Coptis chinensis with Musk(prescription 2)were determined by agar dilution method.The treatment effect of the 2 groups of prescriptions for diabetic foot was observed.ResultsThe MIC of prescription 1 for 35 isolates of ESBLs Escherichia coli was≥128 mg/mL，and the MIC of prescription 2 was 32 mg/mL.The MIC scope of prescription 2 was 32－128 mg/mL.The MIC for 32 isolates of MRSA droped from 32 mg/mL(prescription 1)to 8 mg/mL(prescription 2).Compared with prescription 1，the MIC of prescription 2 decreased significantly，the treatment effect was distinct，and the differences were statistically significant(P＜0.05).ConclusionsTraditional Chinese medicine prescription Coptis chinensis with Musk has inhibitory and treatment effects for diabetic foot producing ESBLs Escherichia coli and MRSA，which is a novel method for clinical treatment.

Traditional Chinese medicine susceptibility test;Extended－spectrum beta lactamase;Escherichia coli; Methicillin－resistant Staphylococcus aureus;Coptis chinensis;Musk;Diabetic foot

1673－8640(2015)03－0261－04

R446.5

A

10.3969/j.issn.1673－8640.2015.03.015

2014－04－15)

梁晓谊，女，1974年生，主管技师，主要从事临床微生物检验工作。