结核分枝杆菌T细胞斑点试验对结核性胸腔积液诊断价值的研究

许雪成，茅利明

(1.绍兴县柯桥街道社区卫生服务中心检验科，浙江绍兴312030; 2.绍兴县中心医院检验科，浙江绍兴312030)

结核分枝杆菌T细胞斑点试验对结核性胸腔积液诊断价值的研究

许雪成1，茅利明2

(1.绍兴县柯桥街道社区卫生服务中心检验科，浙江绍兴312030; 2.绍兴县中心医院检验科，浙江绍兴312030)

目的探讨结核分枝杆菌(MTB)T细胞斑点试验(T－SPOT)在疑似MTB感染伴胸腔积液患者快速诊断中的应用价值。方法疑似MTB感染伴胸腔积液患者124例，应用T－SPOT检测外周血淋巴细胞对MTB特异性分泌蛋白EAST－6和CFP－10的免疫反应。利用MTB DNA法检测胸腔积液中的MTB，同时用免疫金标法检测血清MTB抗体，并进行统计学分析。结果124例疑似患者经过痰和胸腹水抗酸染色镜检、痰液和胸腹水MTB培养、结核菌素皮肤试验、MTB DNA和MTB抗体等试验确诊结核病患者44例，阳性检出率为35.5%。T－SPOT的阳性检出率为33.06%(41/124)，MTB DNA的阳性检出率为14.52%(18/124)，血清MTB抗体的阳性检出率为9.68%(12/124)。对已确诊的44例结核病患者进行数据分析，T－SPOT、MTB DNA和血清MTB抗体的准确率分别为86.36%(38/44)、27.27%(12/44)和18.18%(8/44)。T－SPOT的阳性检出率和结核诊断的准确率均显著高于其它2种方法(P＜0.05)。T－SPOT对疑似MTB感染的胸腔积液患者诊断的阳性预测值为92.68%，阴性预测值为92.77%。结论T－SPOT对疑似MTB感染伴胸腔积液患者的诊断具有快速、高敏感性和高特异性的优点，优于MTB DNA和血清MTB抗体试验，可以作为一种新的技术应用于人体MTB感染的诊断。

T细胞试验;DNA;抗体;结核分枝杆菌;胸腔积液

胸腔积液是临床最常见的症候群，可由恶性肿瘤、肺结核和胸膜结核等疾病引起。患者呈进行性加重的胸痛和呼吸困难，伴胸水(可为血性)，增长速度快，患者的生命受到严重影响。恶性肿瘤引起的胸腔积液可以由肿瘤标志物的血清学检查和胸水查找癌细胞的病理学检查等一系列检查快速确诊。而肺结核或胸膜结核引起的胸腔积液，因为抗酸染色镜检、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)培养和血清MTB抗体的阳性检出率低，MTB培养方法存在敏感性低，检测周期长等问题，导致临床诊断困难。MTB T细胞斑点试验(T cells spot test，T－SPOT)是检测外周血分泌γ干扰素(interferon gamma，IFN－γ)的T淋巴细胞数量的试验，近几年在欧美国家已被证实为在MTB感染检测中具有较好的特异性和敏感性，被广泛用于临床常规检测[1]。本研究拟探讨外周血T－SPOT在明确胸腔积液性质(结核性)的应用价值。

材料和方法

一、研究对象

选择2012年2月至2013年6月因患有胸腔积液而在绍兴县中心医院呼吸内科等相关科室住院的患者。入选标准:咳嗽，呼吸急促、困难，胸部X片和计算机断层扫描检查提示伴有中等量胸腔积液的患者。排除标准:(1)入院前，已经实施抗结核治疗＞1个月者;(2)合并糖尿病以及严重的肝功能、肾功能异常或心功能不全患者;(3)人类免疫缺陷病毒阳性患者。根据上述标准共入选患者124例，其中男80例，女44例，中位年龄59.4 (36～75)岁。均符合2008年8月1日实施的中华人民共和国卫生部发布的中华人民共和国卫生行业标准。

二、方法

1.标本收集住院患者均在清晨安静状态下采集血液标本。检测T－SPOT所需要的标本为:成人抽全血量为4～5 mL，免疫力低或白细胞少的患者抽取8～10 mL，置于肝素抗凝管，充分混匀。检测MTB抗体的血清标本为2 mL全血并置于生化管，静置后在1 500×g离心力下离心5 min分离血清标本备用。MTB DNA法需采集胸腔积液，1 500×g离心取沉渣备用。

2.T－SPOT使用英国Oxford Immunotec公司生产的试剂盒。采集患者外周血并分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PMBC)，用无血清培养液重悬细胞并调节细胞浓度到2.5×106/mL。在阴性对照、阳性对照、A和B孔中分别加入50 μL的无血清培养液、植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)对照、EAST－6和CFP－10。然后每孔加入100 μL的2.5×106/mL的标准细胞溶液，37℃5%CO2环境下孵育16～20 h。磷酸盐缓冲液洗板4次后加入酶结合物溶液于每孔，2～8℃孵育1 h。洗板4次后拍干，加入显色剂，室温孵育10 min。用蒸馏水洗涤4次后充分拍干。用计算机辅助成像技术分析系统进行斑点的阅读与统计。结果判断按照试剂盒说明书进行，即当EAST－6或CFP－10测试孔中的任一个达到以下标准就判断为阳性:(1)阴性对照孔点数0～5，测试孔斑点数－阴性对照孔斑点数≥6;(2)若阴性对照孔斑点数≥6，测试孔斑点数应≥2倍阴性对照孔斑点数。

3.MTB DNA检测胸腔积液沉渣抽提MTB DNA，检测试剂盒由广东达安基因有限公司提供，试剂盒在有效期内。聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增仪为美国ABI公司的7300实时荧光定量PCR仪。

4.血清MTB抗体检测检测所用试剂为上海奥普生物医药公司提供的MTB抗体胶体金法诊断试剂盒，实验原理为斑点免疫金渗滤法。

5.其它确诊试验用于确诊MTB感染的其它试验包括胸水抗酸染色镜检、胸水MTB培养和结核菌素皮肤试验等，均按《全国临床检验操作规程》(第3版)进行。

三、统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，2种方法的阳性率比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结果

一、124例疑似MTB 感染的胸腔积液患者T－SPOT、MTB DNA的阳性率及准确率比较

124例疑似MTB感染的胸腔积液患者用T－SPOT和MTB DNA检测，两者同时阳性16例，T－SPOT阳性而MTB DNA阴性25例，MTB DNA阳性而T－SPOT阴性2例，T－SPOT的阳性检出率为33.06%，MTB DNA的阳性检出率为14.52%，2种方法阳性检出率比较，差异有统计学意义(χ2=11.7，P＜0.05)。见表1。

44例确诊MTB感染的胸腔积液患者用T－SPOT和MTB DNA检测，两者同时阳性8例，T－SPOT阳性而MTB DNA阴性30例，MTB DNA阳性而T－SPOT阴性4例，T－SPOT的准确率为86.36%，MTB DNA的准确率为27.27%，2种方法的准确率比较，差异有统计学意义(χ2=5.436，P＜0.05)。见表2。

二、124例疑似MTB感染的胸腔积液患者T－SPOT、血清MTB抗体的阳性率及准确率比较

124例疑似MTB感染的胸腔积液患者用T－SPOT和MTB抗体检测，两者同时阳性8例，TSPOT阳性而MTB抗体阴性33例，MTB抗体阳性而T－SPOT阴性4例，T－SPOT的阳性检出率为33.06%，MTB抗体的阳性检出率为9.68%，2种方法的阳性检出率比较，差异有统计学意义(χ2= 20.1，P＜0.05)。见表3。

44例确诊MTB感染的胸腔积液患者用T－SPOT和MTB抗体检测，两者同时阳性5例，T－SPOT阳性而MTB抗体阴性33例，MTB抗体阳性而T－SPOT阴性3例，T－SPOT的准确率为86.36%，MTB抗体的准确率为18.18%，2种方法的准确率比较，差异有统计学意义(χ2= 4.728，P＜0.05)。见表4。

三、124例疑似MTB感染的胸腔积液患者TSPOT、MTB DNA及MTB抗体检测

结果见表5。

讨论

结核病是一种严重危害人类健康的传染病，传统的检测方法如痰涂片抗酸染色镜检、痰液MTB培养、结合菌素皮肤试验等都存在着敏感性低、检测周期长等问题。因此结核病的早期快速诊断与治疗已成为制约结核病控制的关键因素。随着科技发展，近年来发展起来的以T细胞免疫应答为基础的IFN－γ释放试验(interferon gamma release assays，IGRAs)被广泛应用于欧美国家的各级医疗机构，列入结核病诊疗指南[2]。IGRAs的原理为:机体首次感染MTB后，体内产生的记忆T淋巴细胞将长期存活于人体内。当机体再次受到MTB感染时，记忆T细胞迅速增殖为效应T细胞，分泌IFN－γ以及其它一些细胞因子刺激T淋巴细胞增殖，同时激活巨噬细胞。T－SPOT利用酶联免疫斑点技术检测MTB特异性的抗原EAST－6和CFP－10[3]。由于IGRAs技术使用的抗原来自于MTB基因组具有而卡介苗缺失的RD区域(region of difference)，所以能够较好地区别卡介苗接种和MTB感染，具有较低的假阳性率，特异性较结核菌素试验有较大提高。从表5中的统计数据我们可以知道，T－SPOT在结核病的诊断中敏感性为86.36%，特异性为96.25%。而据DIEL等[4]的Meta数据分析报道，T－SPOT诊断肺结核的敏感性为85%～90%。本研究数据与国内外相关研究报道近似。

由表1可知，124例疑似MTB感染的胸腔积液患者用T－SPOT和MTB DNA检测，两者同时阳性者16例，T－SPOT单独检测阳性者33例，MTB DNA单独检测阳性者2例，2种方法阳性检出率比较，差异有统计学意义(χ2=11.7，P＜0.05)。而同样根据表3可知，对于T－SPOT和MTB抗体的阳性率比较，两者同时阳性8例，MTB抗体单独检测阳性4例，2种方法阳性检出率比较，差异有统计学意义(χ2=20.1，P＜0.05)。同时，124例疑似MTB感染的胸腔积液患者经过系统痰涂片抗酸染色镜检、胸水涂片抗酸染色镜检和胸水MTB培养、结核菌素皮肤试验、MTB DNA和MTB抗体等试验确诊患结核感染44例，阳性率为35.5%。T－SPOT对结核病的诊断准确率为86.36%，且具有较好的特异性，与参考文献[5]一致。本研究中44例确诊的结核病患者中，按照T－SPOT检测出41例，剩余3例阴性患者，除了试剂本身敏感性所限外，也有可能是实验操作过程中PMBC提取丢失造成的假阴性。此外，T－SPOT还受诸多因素的影响，如年龄、营养不良、化疗和其它传染性疾病等[6]。

综上所述，T－SPOT在诊断MTB感染的胸腔积液患者中具有快速、敏感性较高的优点，可以与其它诊断方法联合应用提高结核病诊断的准确性，对于临床上快速鉴别诊断胸腔积液患者是否为MTB感染具有重要的价值，而且其不受卡介菌和其它分枝杆菌的影响。因此，T－SPOT作为一种新的诊断技术，在结核病的快速临床诊断中具有较好的应用价值。但由于目前该试验的费用比较高，在一定程度上限制了该技术的推广。相信随着国产替代试剂的开发，结核病的实验室诊断会达到一个新的层面。

[1]LAVLANI A.Diagnosing tuberculosis infection in 21st century:new tools to tackle an old enemy[J].Chest，2007，131(6):1898－1906.

[2]BRODIE D，LEDERER DJ，GALLARDO JS，et al.Use of interferon－gamma release assay to diagnose latent tuberculosis infection in foreign－born patients[J].Chest，2008，134(4):869－874.

[3]MAZUREK GH，JEREB J，VERNON A，et al.Updated guidelines for using interferon gamma release assays to detect Mycobacterium tuberculosis infection－United States，2010[J].MMWR Recomm Rep，2010，59(RR－5):1－25.

[4]DIEL R，LODDENKAMPER R，NIENHAUS A，et al.Evidence－based comparison of commercial interferongamma release assays for detecting active TB:a meta analysis[J].Chest，2010，137(4):952－968.

[5]王森，陈嘉臻，张舒，等.血清学诊断方法及T细胞斑点试验在结核病诊断中的应用[J].中华临床感染病杂志，2013，6(1):13－17.

[6]DIELR，LODDENKEMPERR，MEYWALDWALTER K，et al.Comparative performance of tuberculin skin test，Quanti－FERON－TB－Gold in tube assay，and T－SPOT.TB test in contact investigations for tuberculosis[J].Chest，2009，135(4):1010－1018.

Study on the diagnostic significance of T cells spot test in Mycobacterium tuberculosis infected patients with pleural effusion

XU Xuecheng1，MAO Liming2.(1.Department of Clinical Laboratory，Keqiao Community Health Center，Zhejiang Shaoxing 312030，China;2.Department of Clinical Laboratory，Shaoxing County Central Hospital，Zhejiang Shaoxing 312030，China)

ObjectiveTo investigate the application significance of Mycobacterium tuberculosis(MTB)T cells spot test(T－SPOT)in the rapid diagnosis for suspected MTB infected patients with pleural effusion.MethodsThe 124 patients with pleural effusion which were suspected as having suspected MTB infection were enrolled.T－SPOT was used to detect the immune response of peripheral blood lymphocyte against MTB special secreted protein EAST－6 and CFP－10.The MTB DNA method was used to detect MTB in pleural effusion，meanwhile serum anti－MTB antibody was detected by immuno－gold filtration assay，and the results were analyzed statistically.ResultsThe 44 of 124 cases were diagnosed as tuberculosis by sputum，pleural effusion and ascites smear test，sputum，pleural effusion and ascites MTB culture，tuberculin test，MTB DNA method and anti－MTB antibody test，and the positive rate was 35.5%.The positive rate of T－SPOT in the 124 patients with pleural effusion was 33.06%(41/124).The positive rate of MTB DNA method was 14.52%(18/124)，and that of anti－MTB antibody test was 9.68%(12/124).Among the 44 confirmed tuberculosis patients，T－SPOT had the consistency rate of 86.36%(38/44)，while the consistency rates of MTB DNA method and anti－MTB antibody test were 27.27%(12/44)and 18.18%(8/44)，respectively.The positive rate and consistency rate of T－SPOT were significantly higher than those of the others(P＜0.05).The positive and negative predictive values of T－SPOT in suspected MTB infected patients with pleural effusion were 92.68%and 92.77%，respectively.ConclusionsT－SPOT is fast，sensitive and specific to diagnose the suspected MTB infected patients with pleural effusion.T－SPOT is better than MTB DNA method and anti－MTB antibody test.T－SPOT can become a new diagnostic method to be applied in the diagnosis of MTB infection.

T cells spot test;DNA;Antibody;Mycobacterium tuberculosis;Pleural effusion

1673－8640(2015)03－0254－04

R446.5

A

10.3969/j.issn.1673－8640.2015.03.013

2014－02－10)

(本文编辑:姜敏)

许雪成，男，1977年生，主管技师，主要从事临床检验工作。