乳胶颗粒凝集法检测梅毒特异性抗体的性能评估

胡亮，陈艺，陈长强，瞿晨芸，顾志冬，樊绮诗

(1.上海交通大学医学院附属瑞金医院北院检验科，上海201801; 2.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海200025)

乳胶颗粒凝集法检测梅毒特异性抗体的性能评估

胡亮1，陈艺1，陈长强1，瞿晨芸1，顾志冬2，樊绮诗1

(1.上海交通大学医学院附属瑞金医院北院检验科，上海201801; 2.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海200025)

目的对乳胶颗粒凝集法梅毒螺旋体特异性抗体检测试剂(Mediace TPLA)进行性能评估。方法参考美国临床实验室标准化协会(CLSI)EP系列文件，评估Mediace TPLA的分析性能。用Mediace TPLA检测111例梅毒确诊患者和78例排除梅毒感染者的血清，并与化学发光微粒子免疫分析法(CMIA)进行比较。结果Mediace TPLA检测结果在8.0、28.6及166.0 T.U.这3个水平的总变异系数(CV)分别为8.77%、3.94%和6.57%;检测线性范围为0～250 T.U.;总回收率为95.31%;一定程度的溶血(血红蛋白＜4.8 g/L)、脂血(甘油三酯＜8 mmol/L)、黄疸(胆红素＜20 μmol/L)及类风湿因子(＜450 IU/mL)对检测结果无明显影响;排除梅毒感染的30例抗核抗体(ANA)阳性患者、10例肝炎患者及10例妊娠期妇女血清检测结果为阴性。以CMIA结果为相对标准，Mediace TPLA Cut－off值取10 T.U.时，其检测灵敏度为99%、特异性为100%。结论Mediace TPLA具有抗干扰能力强、重复性好、准确性好、线性范围宽及特异度高等特点，可在全自动生化分析仪中使用。

梅毒;乳胶颗粒凝集法;血清学检测

梅毒(syphilis)是由梅毒螺旋体感染人体所引起的一种常见的性传播疾病。其特点为病程长，病变可以侵蚀皮肤黏膜及全身各个组织器官，临床表现多种多样，妇女感染后如不治疗可垂直传染给下一代[1]。近年来，梅毒发病率呈上升趋势。根据中国疾病预防控制中心发布的《2012年度全国法定传染病疫情概况》的数据，2012年我国梅毒发病人数逾40万，居乙类传染病第3位。梅毒已是临床输血前、术前及孕前等筛查的基本项目之一。传统的梅毒螺旋体检测方法有快速血浆反应素试验(syphilis rapid plasma reagin，RPR)、甲苯胺红不加热血清反应素试验(tolulized red unheated serum test，TRUST)、荧光密螺旋体抗体吸收试验(fluorescentTreponemalantibody absorption，FTA－ABS)、梅毒螺旋体明胶凝集试验(Treponema pallidum particle agglutination，TPPA)、梅毒螺旋体血凝试验(treponema pallidum hemagglutination assay，TPHA)、酶联免疫吸附试验(enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA)和胶体金法等，这些方法由于没有实现自动化、操作繁琐，已不能满足临床实验室快速、准确检测的要求。近年来，以化学发光为原理的梅毒螺旋体抗体检测方法正逐步应用于临床，但需配套设备，只能在有条件的实验室开展。

乳胶颗粒凝集法梅毒螺旋体特异性抗体检测试剂(mediace triponema pallidum latex agglutination，Mediace TPLA)是一种较新的、可开放用于不同检测系统的梅毒血清学检测试剂。为了评估该试剂的临床适用性，我们参照美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)EP系列文件，对其进行性能评估，并与化学发光微粒子免疫分析法(chemiluminescent microparticle immunoassay，CMIA)进行比较，为临床实验室选择梅毒自动化检测方法提供参考。

材料和方法

一、材料

收集上海交通大学医学院附属瑞金医院、瑞金医院北院检验科2012年12月至2013年9月的梅毒阳性血清111例、阴性血清78例，排除梅毒感染的ANA阳性患者血清30例、肝炎患者血清10例及妊娠期妇女血清10例。梅毒的诊断主要依靠实验室血清学检查，本研究中梅毒阳性血清的判断标准为TPPA及CMIA检测结果同时阳性，梅毒阴性或排除梅毒感染血清的判断标准为RPR、TRUST、TPPA及CMIA检测结果均为阴性。所有对象采用真空管采集静脉血，2 100×g离心5 min，分离血清后于－20℃保存待用。

二、方法

1.Mediace TPLA采用乳胶颗粒凝集法进行检测，试剂及配套定标品、质控品由日本积水医疗株式会社生产，仪器为BECKMAN－COULTER AU5800全自动生化分析仪。按试剂说明书设置该项目的参数，血清9 μL、第1试剂(R1)105 μL、第2试剂(R2)15 μL、测定波长700 nm。

2.梅毒抗体(TP－Ab)的检测采用CMIA测定血清中的梅毒螺旋体特异性抗体，试剂及标准品为美国雅培公司产品，使用上海市临床检验中心梅毒特异性抗体质控品，仪器为雅培Architect i2000化学发光分析仪。严格按试剂说明书及仪器操作手册进行试验。

3.精密度试验根据CLSI EP5－A2文件[2]，选择低、中、高3个浓度水平的标本，每天上、下午分2批实验，每批做双份检测，连续检测20 d，一共有240个数据。计算出批内不精密度的标准差(s批内)、批间不精密度的标准差(s批间)、天间不精密度的标准差(s天间)，最后按照方差和的方式将批内、批间和天间标准差结合起来求出总标准差(s总)，计算出总变异系数(coefficient of variation，CV)。

4.干扰试验计算加入干扰物质后的实测值，共重复检测4次，取平均值，与预期值比较，得到回收率。

5.分析测量范围根据CLSI EP6－A文件[3]，采用多项式回归方案进行线性评价试验。分别选取Mediace TPLA低值(0.5 T.U.)和高值(237.0 T.U.)血清，按比例进行梯度稀释。所有样品充分混匀，随机排列上机检测，每个样品重复检测4次。T.U.是参考世界卫生组织(WHO)标准品[THE INTERNATIONAL STANDARD for SYPHILITIC HUMAN SERUM(1stinternational standard preparation，established in 1958)]设定的，1 T.U.相当于2 mIU。

6.灵敏度与特异度以CMIA检测结果为相对标准，用Mediace TPLA检测111例、78例TP－Ab阳性、阴性标本，按说明书建议的Cut－off值(10 T.U.)计算其灵敏度与特异度。

三、统计学方法

使用Excel 13.0计算均数(x－)、标准差(s)，并进行相关性分析。

结果

一、精密度试验

精密度试验结果显示，3个浓度水平的总变异系数(CV)均＜10%，见表1。

二、干扰试验

干扰试验的结果均在95%～105%之间，提示试剂的抗干扰能力较强，见表2。

排除梅毒感染的30例ANA阳性患者血清、10例妊娠期妇女血清及10例肝炎患者血清均未对Mediace TPLA检测结果产生干扰。

三、分析测量范围

线性试验结果显示相关系数(r)为0.996;评价结果显示Mediace TPLA在0～250 T.U.范围内呈线性关系。见图1。

四、灵敏度与特异度

以CMIA检测结果为相对标准，按说明书建议的Cut－off值，其灵敏度为99%、特异度为100%。见表3。经统计，CMIA定量检测结果与Mediace TPLA定量检测结果在各自线性检测范围内无相关性，见图2。

189例标本中存在1例Mediace TPLA与CMIA结果不符的情况，Mediace TPLA结果为阴性，而化学发光结果为弱阳性。用RPR、TRUST及TPPA复检该标本，结果均为阴性。

讨论

机体感染梅毒螺旋体后可产生非梅毒螺旋体类脂质抗体[即反应素(reagin)]和梅毒螺旋体特异性抗体(TP－Ab)。目前，临床上常用TRUST、RPR等方法检测其非特异性抗体，化学发光法、TPPA、TPHA、ELISA、FTA－ABS、胶体金等方法检测其特异性抗体。上述试验多为手工方法，操作繁琐、耗时长、人为影响因素较多[4]。CMIA的灵敏度与TPPA相当，兼具快速、高通量等优点，但不能开放用于其它仪器[5]。Mediace TPLA是能应用于各种开放生化检测平台的梅毒螺旋体抗体检测试剂，为了分析其临床适用性，本研究对其进行了性能评估。

本研究表明，Mediace TPLA具有良好的批内、批间和天间精密度，分析测量范围较宽，测定结果不受轻度溶血、脂血、生理浓度的胆红素及类风湿因子的影响，与现有的只能用于配套检测系统的免疫分析试剂性能相当。常见的易对梅毒检测结果造成干扰的病理生理情况，如自身免疫性疾病、妊娠、肝炎等也均未对Mediace TPLA的检测结果产生干扰。本研究结果显示CMIA定量检测结果与Mediace TPLA定量检测结果之间在各自线性范围内无相关性，这与WATANABE等[9]的研究结束一致，推测可能是由于不同检测方法所包被的抗原不同所引起，故在进行方法学替代阶段应及时向临床说明。

本研究同时用Mediace TPLA及CMIA检测189例梅毒阴阳性血清，以CMIA结果为相对标准，发现Mediace TPLA的灵敏度及特异度均较高。189例结果中存在1例不符的情况，该例标本Mediace TPLA检测结果为阴性(－1.1 T.U.，Cut－off值为＜10 T.U.)，而CMIA检测结果为弱阳性(1.17 S/CO，Cut－off值为＜1 S/CO)。用RPR、TRUST及TPPA复检，结果均为阴性。结合该患者的病史、症状、体征，可基本排除梅毒既往及现症感染。在临床工作中，CMIA出现假阳性的情况也会出现。有研究者已对化学发光法假阳性的原因进行了分析，试剂方面的可能原因包括合成的基因重组多肽抗原过长、抗原数量有限、抗原不纯、以血清白蛋白作为桥联等使非特异性反应增高[6－8]。故在梅毒诊治过程中应结合病史、症状、体征及多种血清学检测方法进行综合判断。同时，对CMIA结果应制定相应的复检规则。

总之，采用Mediace TPLA快速检测梅毒螺旋体性抗体，具有常规手工方法的基本性能，可排除人为操作和判断结果的误差。同时，因能开放应用于自动生化分析仪，可快速检测大量标本，提高工作效率，在献血员筛查、健康人群查体及临床应用中都具有一定的优势[10]。

[1]陈祥生.我国梅毒流行现状及防治策略[J].国际流行病学传染病学杂志，2008，35(2):73－77.

[2]Clinical and Laboratory Standards Institute.Evaluation of precision performance of quantative measurement methods;approved guideline－2nd ed[S].EP5－A2， CLSI，2004.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute.Evaluationof the linearity of quantitative measurement procedures:a statistical approach;approved guideline[S].EP6－A，CLSI，2003.

[4]王华成，陈茶，杨梦心，等.乳胶凝集免疫比浊法检测梅毒特异性抗体的性能评价[J].国际检验医学杂志，2012，33(15):1877－1878.

[5]袁明生.化学发光微粒子免疫分析法检测梅毒螺旋体抗体的应用评价[J].检验医学，2010，25 (7):571－572.

[6]傅均星，周潇，曾铁兵.基因重组抗原ELISA法在梅毒螺旋体抗体检测中的评价[J].南华大学学报:医学版，2004，32(3):305－306.

[7]王柳溪.TP－ELISA法检测老年人梅毒抗体易产生假阳性原因分析[J].医学理论与实践，2008，21 (9):1085－1086.

[8]郭慧娟，尚晓泓.微粒子化学发光法检测梅毒抗体阳性结果分析[J].检验医学与临床，2011，8 (20):2444－2445.

[9]WATANABE N，NAGATOMO R，OKUBO S，et al.Evaluationoflatexagglutinationtestforantitreponemal antibody in comparison with chemical luminescence tests[J].Rinsho Byori，2011，59(2): 115－120.

[10]HUH HJ，LEE KK，KIM ES.et al.Analysis of positive results in mediace rapid plasma reagin and treponemapallidumlatexagglutinationasthe automated syphilis test[J].Korean J Lab Med，2007，27(5):324－329.

Evaluation on the performance of a latex agglutination assay for treponemal specific antibody

HU Liang1，CHEN Yi1，CHEN Changqiang1，QU Chenyun1，GU Zhidong2，FAN Qishi1.(1.Department of Clinical Laboratory，Ruijin Hospital(North)，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 201801，China;2.Department of Clinical Laboratory，Ruijin Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200025，China)

ObjectiveTo evaluate the analytic performance of a latex agglutination assay for treponemal specific antibody(Mediace TPLA).MethodsThe EP documents established by Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)were referred to evaluate the analytic performance.A total of 110 syphilitic positive and 78 syphilitic negative sera were detected by Mediace TPLA，and the results were compared with those of chemiluminescence microparticle immunoassay(CMIA).ResultsThe total coefficients of variation(CV)were 8.77%，3.94%and 6.57% respectively at the concentration levels of 8.0，28.6 and 166.0T.U..The linear range was from 0 to 250 T.U.，and the total recovery rate was 95.31%.The results were not significantly affected by hemolysis(hemoglobin＜4.8 g/L)，lipidemia(triglyceride＜8 mmol/L)，jaundice(bilirubin＜20 μmol/L)and rheumatoid factor(＜450 IU/mL).The results of 30 antinuclear antibody(ANA)positive patients，10 hepatitis patients and 10 pregnant women were all negative.When the results of CMIA were defined as the reference standard，the sensitivity of Mediace TPLA was 99%，the specificity was 100%，and the cut－off value was 10 T.U..ConclusionsMediace TPLA has excellent antiinterference ability，repeatability，high accuracy，wide linear range and specificity.It can also be used in automated biochemical analyzers.

Syphilis;Latex agglutinaion assay;Serological detection

1673－8640(2015)03－0250－04

R446.1

A

10.3969/j.issn.1673－8640.2015.03.012

2014－06－18)

(本文编辑:龚晓霖)

上海市科学技术委员会科研计划项目(14411964500);上海申康医院发展中心资助项目(SHDC12010215)

胡亮，男，1987年生，学士，技师，主要从事临床免疫学检验工作。

顾志冬，联系电话:021－67888237。