miR-486-5p在氧化应激引起人骨髓间充质干细胞凋亡中的作用*

胡 明， 黎 佼， 刘宁宁， 黄桢钧， 伍崇海， 钟 赟， 刘世明

(广州医科大学附属第二医院，广州心血管疾病研究所，广东 广州 510260)



miR-486-5p在氧化应激引起人骨髓间充质干细胞凋亡中的作用*

胡 明▲， 黎 佼▲， 刘宁宁， 黄桢钧， 伍崇海， 钟 赟， 刘世明△

(广州医科大学附属第二医院，广州心血管疾病研究所，广东 广州 510260)

目的： 观察microRNA-486-5p(miR-486-5p)在氧化应激引起人骨髓间充质干细胞(hMSCs)凋亡中的作用并探讨其作用机制。方法: hMSCs经培养鉴定后分为5组：空白对照组、H2O2组、miR-486-5p模拟物+H2O2组、抑制物(αnti-miR)+H2O2组及相应的阴性对照(scrambled control)+H2O2组。荧光定量PCR(real-time PCR)检测氧化应激诱导hMSCs凋亡过程中miR-486-5p的表达变化。用脂质体分别转染miR-486-5p的模拟物、抑制物及阴性对照到hMSCs。应用MTT、Hoechst标记和流式细胞术的方法检测miR-486-5p对氧化应激介导细胞活性下降及凋亡效应的影响，Western blotting检测凋亡相关蛋白、Akt与其磷酸化水平，采用试剂盒测定caspase-3活性。结果: H2O2诱导hMSCs凋亡过程中miR-486-5p的表达较对照组显著下降(P<0.05)。与阴性对照组相比，在hMSCs中过表达miR-486-5p，能使细胞在氧化应激情况下活性显著下降，凋亡发生率增高，蛋白Bcl-2/Bax比值、caspase-3酶原含量及Akt磷酸化水平降低，caspase-3活性增强；而使用抑制物阻遏miR-486-5p的作用后，细胞在氧化应激条件下活性增加，凋亡发生率降低，蛋白Bcl-2/Bax比值及Akt磷酸化水平升高，caspase-3活性下降。结论: 过表达miR-486-5p促进氧化应激引起的hMSCs凋亡，阻遏miR-486-5p的作用抑制氧化应激条件下的hMSCs凋亡，其中作用机制可能与调控Akt通路有关。

MicroRNA-486-5p； 间充质干细胞； 氧化应激； 细胞凋亡

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)作为成体干细胞的一种,由于来源方便，没有免疫排斥反应，无致瘤性，是较为理想且具有临床运用前景的一类干细胞。移植BMSCs治疗心梗的动物实验和临床前期试验取得了令人鼓舞的成果，但临床试验效果差异较大，而且获益主要来自于早期的心功能改善，对远期全因死亡等终点事件无明显改善，这其中心梗后局部恶劣的微环境限制了移植细胞的存活是主要原因之一。心梗发生后，心肌缺血缺氧的同时会诱导活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)生成增多，启动氧化应激反应(oxidative stress，OS)。移植到心梗周边区的BMSCs会因缺血缺氧而诱发凋亡，同时也会在氧化应激作用下发生损伤。因此，如果能够采取方法减少梗死后微环境诱发的移植细胞凋亡，将对提高干细胞移植疗效有重大意义。微小RNA(microRNA，miRNA)作为细胞内一类重要的调控分子，调控着细胞分化、增殖、代谢及凋亡等一系列生物学过程[1]。过表达miR-486-5p促进人脂肪间充质干细胞(human adipose tissue-derived MSCs，hAT-MSCs)复制性衰老[2]，低剂量的H2O2也可诱导MSCs提早发生衰老，而大剂量H2O2诱发凋亡[3]，那么我们推测miR-486-5p可能在H2O2诱导的MSCs凋亡中起作用。本研究拟通过H2O2刺激细胞模拟心梗后局部微环境中氧化应激诱导移植的人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells，hMSCs)凋亡，观察miR-486-5p在氧化应激引起hMSCs凋亡中的作用并探讨其可能的作用机制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 人骨髓的提取 通过广州医科大学附属第二医院伦理委员会审查，并与患者签订知情同意书后，在广州医科大学附属第二医院心外科瓣膜病患者开胸手术过程中吸取人骨髓5mL。供体排除肿瘤、肝炎、结核、HIV感染等因素。

1.2 主要试剂及仪器 胎牛血清、Opti-MEM和IMDM培养基(Gibco)；3% H2O2(Sigma)；Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(Invitrogen)；SYBR Green 荧光定量试剂盒和RNA逆转录试剂盒(Toyobo)；Annexin V-FITC Apoptosis detection kit(eBioscience)；caspase-3活性检测试剂盒(Beyotime)；兔抗Akt、p-Akt和caspase-3抗体(Cell signalling)；Bax、Bcl-2及GAPDH抗体(Santa Cruz)；淋巴细胞分离液(Ficoll)；荧光定量PCR仪(ABI7300)；多功能酶标仪(Tecan)等。

2 方法

2.1 hMSCs的分离、培养、鉴定及H2O2预处理 hMSCs的分离、培养及鉴定参照文献报道[4-5]。在淋巴细胞分离液上叠加入人骨髓液，以2 000 r/min在4 ℃下离心20min，吸取分离液和血浆界面云雾状的单个核细胞，用IMDM悬浮并以1 000 r/min离心。后按2×109/m2密度接种于培养瓶中培养，48h后换液，将不贴壁的细胞除去。贴壁细胞每3d换液，待细胞融合度达80%～90%时，胰酶消化传代。流式细胞术检测细胞表面CD29、CD31、CD34、CD44、CD45和CD166的表达。选择P3/P4代细胞，首先细胞转染24h，然后用H2O2预处理诱导凋亡，参见文献报道[6]，细胞在无血清IMDM培养8 h，然后加入10 mmol/L H2O2处理8 h以诱导凋亡，后按实验需要处理细胞。

2.2 Real-time PCR检测H2O2诱导hMSCs凋亡过程中miR-486-5p的表达变化 按Trizol试剂盒说明书的操作步骤提取贴壁培养的hMSCs的总RNA；按逆转录反应试剂盒说明书操作进行逆转录反应(37 ℃ 15min，98 ℃ 5min)，反应产物进行PCR扩增；PCR过程按试剂盒说明书操作在ABI7300荧光定量PCR仪上进行。PCR反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个PCR循环。miRNA使用U6作为内参照进行PCR，获得Ct值后，目的基因的相对定量按2-ΔΔCt计算。

2.3 细胞转染 按Lipofectamine RNAiMAX说明书操作，hMSCs密度达70%～80%时分别转染miR-486-5p模拟物、抑制物(anti-miR)及其相应的阴性对照miR-CTL、anti-CTL，转染终浓度为30 nmol/L，细胞转染24h后进行H2O2预处理。转染一般步骤参见转染说明书。相关miRNA序列见表1。

表1 DNA和RNA寡核苷酸序列

F: forward; R reverse.

2.4 MTT检测细胞活力 取对数生长期细胞，以100 μL每孔(约6×103个细胞)接种于96孔板。按实验要求给予不同处理，每组设5个平行孔。处理完毕后，每孔加入50 μL MTT，孵育4 h后吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO，水平摇床摇匀，待蓝紫色结晶完全溶解后，酶标仪在550 nm波长处检测每孔的吸光度(A)。细胞存活率(%)=实验组A/对照组A×100%。

2.5 Hoechst 33342染色观测凋亡细胞 将hMSCs接种在24孔板上，各实验组按要求给予不同处理，PBS洗1～2次后加入4%多聚甲醛于4 ℃固定细胞30 min，后PBS洗涤1次，再加10 mg/L Hoechst 33342于37 ℃染色15 min后立即荧光检测。正常细胞核出现均匀强度的荧光；如出现染色质固缩和(或)核碎裂则为凋亡的细胞。

2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 各实验组按实验要求给予不同处理后，按Annexin V-FITC凋亡测定试剂盒(eBioscience)中的操作步骤，每实验组收集2×105个细胞，PBS洗涤1次，离心后重悬于200 μL缓冲液，加入5 μL Annexin V-FITC混合，室温下避光孵育10 min。而后加入10 μL PI并立即通过流式细胞仪检测，Annexin V+/PI-视为早期凋亡细胞，Annexin V+/PI+和Annexin V-/PI+为晚期凋亡和死亡细胞，Annexin V-/PI-则为活细胞。

2.7 Western blotting检测Akt、p-Akt、caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白水平 每组收集约4×105个细胞，蛋白裂解液进行蛋白提取，BCA法测定蛋白浓度。各组等量蛋白用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜，转过蛋白的硝酸纤维素膜于室温下用5%脱脂牛奶封闭1 h，而后与相应Ⅰ抗于4 ℃下孵育过夜 [多克隆兔抗磷酸化Akt(1∶500)、Akt(1∶1 000)、caspase-3(1∶1 000)或兔抗Bax(1∶500)，鼠抗Bcl-2(1∶100)]。TBST洗膜后连接辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗(1∶5 000)作为探针。目的蛋白特异条带化学发光法显影，经GAPDH(1∶5 000)信号标准化，并通过Image-Pro Plus软件半定量分析，磷酸化与非磷酸化蛋白的比值代表蛋白磷酸化水平。

2.8 Caspase-3的活性测定 每组收集约4×105细胞，PBS洗涤1次后，加入25 μL裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15 min后4 ℃ 16 000×g离心10min,提取上清后立即按caspase-3活性检测试剂盒说明测定活性。

3 统计学处理

数据用均数±标准差(mean±SD)表示，应用SPSS 13.0统计软件分析，两组间的差异显著性采用独立样本t检验，多组间的差异显著性采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 hMSCs氧化应激诱导凋亡中miR-486-5p的表达变化

如图1A所示，采用H2O2诱导hMSCs凋亡后，用real-time PCR方法检测miR-486-5p的表达变化，结果显示，H2O2组miR-486-5p的表达水平较control组明显下调(P<0.05)。

2 miR-486-5p对H2O2引起hMSCs活性下降的影响

如图1B所示，H2O2刺激后，与阴性对照组相比，转染miR-486-5p模拟物的hMSCs的细胞活性显著下降；而抑制miR-486-5p的表达则能使hMSCs的细胞活性增高，差异有统计学意义(P<0.05)。

Figure 1.The changes of miR-486-5p expression in oxidative stress-related apoptosis of hMSCs (A) and the effect of miR-486-5p on H2O2-induced decrease in cell viability (B). SC:scrambled control.Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs SC+H2O2.

3 miR-486-5p在氧化应激诱导hMSCs凋亡中的作用

如图2所示，Hoechst荧光染色后，在荧光显微镜下观察到control组细胞核出现均匀的低强度荧光；而在各H2O2处理组中均出现胞核浓缩致密、呈颗粒状高强度的荧光。转染miR-486-5p组与阴性对照组相比，浓缩致密、颗粒状高强度荧光明显增多；而miR-486-5p抑制物组相比对照组，浓缩致密的高强度荧光减少。Annexin/PI双染色法流式检测显示，H2O2处理后，早凋和晚凋细胞比例相对control组均显著增加(P<0.05)。氧化应激处理后，转染miR-486-5p模拟物的hMSCs与阴性对照组的早期凋亡率分别为7.80%±1.68%和6.09%±0.76%，而晚期凋亡率分别为19.72%±3.86%和15.48%±2.63%，这说明过表达miR-486-5p促进H2O2诱导的hMSCs凋亡；而抑制miR-486-5p的表达则拮抗H2O2诱导的hMSCs凋亡(P<0.05)。

Figure 2.The role of miR-486-5p in H2O2-induced hMSC apoptosis. A: apoptosis of hMSCs analyzed by Hoechst 33342 staining. Brightly stained nucleus of hMSCs represents the cells undergoing apoptosis (×20). B: apoptosis was also analyzed by flow cytometry after staining with Annexin V and propidium iodide (PI). C: the quantitative analysis of apoptosis. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs SC (scambled control)+H2O2.

4 miR-486-5p对氧化应激介导hMSCs凋亡相关蛋白表达、Akt磷酸化水平及caspase-3活性的影响

Akt磷酸化水平在经过H2O2处理后明显下降(P<0.05)。与阴性对照组相比，在hMSCs中过表达miR-486-5p，能使细胞在氧化应激情况下，Bcl-2/Bax比值、caspase-3酶原含量及Akt磷酸化水平下降(P<0.05)；而使用抑制物阻遏miR-486-5p的作用后，Bcl-2/Bax比值、caspase-3酶原含量和Akt磷酸化水平升高(P<0.05)。H2O2刺激后，过表达miR-486-5p造成caspase-3活性增加，而转染miR-486-5p抑制物组与阴性对照组相比，caspase-3活性显著下降(P<0.05)，见图3。

Figure 3.The levels of apoptosis-related proteins and phosporylation of Akt determined by Western blotting, and the caspase-3 activity detected by a kit in transfected hMSCs after treated with H2O2. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs anti-control+H2O2; #P<0.05 vs miR-control+H2O2; △P<0.05 vs control; ▲P<0.05 vs SC+H2O2.

讨 论

心梗发生后，心肌缺血缺氧和再灌注损伤过程中，ROS生成增多，清除减少，启动氧化应激反应，不仅导致局部组织细胞的损伤，也阻碍移植到心梗周边区BMSCs的迁徙、分化，甚至直接导致移植细胞凋亡或坏死，从而从根本上限制其移植疗效。目前单纯BMSCs移植治疗心梗远期获益不明显，而进行缺氧、细胞因子、小分子药物或基因调控等预处理后移植治疗能提高植入心脏后BMSCs的存活能力，并产生更好的移植效果。miRNA作为转录后调控小分子，能够与靶基因mRNA的3’-UTR结合，降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。基于其特殊的调控方式，miRNA作为表观遗传修饰的靶点有其特有优势[7]。近年来，miRNA作为细胞内一类重要的调控分子，已被发现在细胞的凋亡信号转导中发挥了关键作用[8]。目前已有多个研究证实miR-486在调控癌细胞生长、侵袭及凋亡中发挥作用并能够充当一些癌症的生物学标记[9-10]。而关于miR-486在hMSCs凋亡中的作用迄今尚未见文献报道。

在哺乳动物细胞凋亡过程中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspases)家族的激活起关键作用，正常细胞的caspases处于非活化的酶原状态，凋亡程序一旦启动，caspases被激活并随后发生凋亡蛋白酶级联反应，从而导致细胞DNA损伤和细胞凋亡。不同的启动性caspase介导不同的凋亡信号，如caspase-8介导死亡受体相关信号，而caspase-9介导线粒体途径的死亡信号。虽然在不同细胞或同一细胞受不同刺激诱发凋亡过程中，caspases的激活不尽相同，但普遍认为激活caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路。关于miR-486在氧化应激引起hMSCs凋亡中的作用，本研究通过采用Hoechst染色，流式细胞术，caspase-3活性测定，凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及caspase-3酶原测定等方法，证实miR-486-5p调节氧化应激引起的hMSCs凋亡。流式细胞术结果显示，相比control组，H2O2诱导的hMSCs早期凋亡变化不是很明显，而加大H2O2浓度刺激后，死细胞又大量出现(数据未显示)。这与文献报道相一致，可能与MSCs更能耐受H2O2氧化应激刺激有关[11]。

PI3K/Akt通路是蛋白激酶瀑布中的核心成分，参与调控细胞生长、代谢及凋亡等多种病理生理过程[12]。Akt修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)拮抗凋亡能力增加，移植入心梗后能增强修复梗死心肌的能力[13]。生物信息学软件预测PI3K/Akt通路中的多种成分都是miR-486的作用靶点，且部分已得到证实[10, 14]。有证据表明PI3K/Akt通路在H2O2诱导MSCs凋亡中起重要作用[15-16]，H2O2诱导凋亡并同时伴Akt活性的下降。本研究通过Western blotting技术检测Akt蛋白与其磷酸化水平，发现Akt磷酸化水平在经过氧化应激处理后明显下降，而阻遏miR-486-5p的作用能抑制氧化应激引起的hMSCs凋亡，并且同时伴随Akt活性明显升高，因此推测其作用可能是通过增强Akt通路活性来实现的。至于miR-486-5p在氧化应激介导hMSCs凋亡中的作用靶点及具体调控机制有待进一步研究。

综上所述，H2O2诱导hMSCs凋亡过程中miR-486-5p的表达发生下降；过表达miR-486-5p促进氧化应激引起的hMSCs凋亡，而阻遏miR-486-5p的作用抑制氧化应激条件下的hMSCs凋亡，而且其中作用机制可能与参与调控Akt通路有关。研究结果为寻找提高移植干细胞存活能力提供了新的作用靶点，对于进一步的研究具有重要的理论和现实意义。

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Role of miR-486-5p in apoptosis of human bone marrow mesenchymal stem cells induced by hydrogen peroxide

HU Ming, LI Jiao, LIU Ning-ning, HUANG Zhen-jun, WU Chong-hai, ZHONG Yun, LIU Shi-ming

(TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,GuangzhouInstituteofCardiovascularDisease,Guangzhou510260,China.E-mail:gzliushiming@126.com)

AIM: To investigate the role of microRNA-486-5p (miR-486-5p) in the apoptosis of human bone marrow mesenchymal stem cells (hMSCs) induced by hydrogen peroxide (H2O2). METHODS: The hMSCs were culturedinvitroand exposed to serum-free medium and H2O2(10 mmol/L). The changes of miR-486-5p expression in oxidative stress-related apoptosis of hMSCs were measured by real-time PCR. The hMSCs were transfected with miR-486-5p mimic or inhibitor at concentration of 30 nmol/L by Lipofectamine RNAiMAX. The effect of miR-486-5p on H2O2-induced decrease in cell viability was evaluated by MTT assay. Hoechst 33342 staining and flow cytometry were applied to determine the role of miR-486-5p in the apoptosis of hMSCs. The protein expression was evaluated by Western blotting. Caspase-3 activity was determined using a caspase-3 activity kit. RESULTS: Compared with control group, the expression of miR-486-5p significantly decreased after treated with H2O2(P<0.05). In addition, over-expression of miR-486-5p in the hMSCs reduced the cell viability, accelerated apoptosis, down-regulated Bcl-2/Bax ratio, caspase-3 enzyme precursor content and phosphorylation of Akt, and activated caspase-3 activity. Conversely, down-regulation of miR-486-5p significantly inhibited H2O2-induced cell apoptosis and the caspase-3 activity, increased cell viability and up-regulated Bcl-2/Bax ratio and phosphorylation level of Akt. CONCLUSION: Over-expression of miR-486-5p promotes H2O2-induced hMSCs apoptosis, and repression of miR-486-5p protects hMSCs from H2O2-induced cellular apoptosis, which may be mediated by regulating Akt signaling pathway.

MicroRNA-486-5p; Mesenchymal stem cells; Oxidative stress; Apoptosis

1000- 4718(2015)03- 0524- 06

2014- 10- 28

2014- 12- 14

广州市属高校科研项目(No. 2012C230)； 广东省科技计划(No.2013B021800198)； 国家自然科学基金青年基金资助项目(No. 81401156)

△通讯作者 Tel: 020-34153522; E-mail:gzliushiming@126.com

▲并列第1作者

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.024