骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠RANKL/OPG平衡及MAPK信号通路的影响

朱振标，林之斌，丁晓莉，刘亦恒

(海口市人民医院骨科中心，海南 海口 570208)

骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠RANKL/OPG平衡及MAPK信号通路的影响

朱振标，林之斌，丁晓莉，刘亦恒

(海口市人民医院骨科中心，海南 海口 570208)

目的 观察骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠核因子κB受体活化因子配体(RANKL)/骨保护素(OPG)表达及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的影响。方法选用雌性大鼠45只，分为假手术组(15只)和手术组(30只)，手术组行双侧卵巢切除术，造模12周时测定BMD，确认OP复制成功后，将手术组大鼠又随机分为模型组和骨碎补总黄酮给药组，每组均15只；给药组大鼠给予骨碎补总黄酮灌胃，持续时间为12周，模型组和假手术组同时给予等量生理盐水灌胃；实验结束后测定大鼠的BMD，ELISA法检测大鼠血清RANKL、OPG含量，RT-PCR检测大鼠骨组织RANKL、OPG mRNA表达，Western blot法检测骨组织c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38MAPK(p38)、细胞外调节激酶(ERK)的磷酸化水平及c-Fos表达。结果干预治疗12周后：(1)与假手术组相比，模型组大鼠左、右股骨BMD降低(P＜0.05)，血清RANKL含量增加、OPG含量降低、RANKL-OPG比值增大(P均＜0.05)，骨组织RANKL mRNA表达增加、OPGmRNA表达减少(P均＜0.05)。(2)与模型组比较，假手术组和骨碎补总黄酮治疗组左、右股骨BMD均增加(P均＜0.05)，血清RANKL含量降低、OPG含量增加、RANKL-OPG比值减小(P均＜0.05)，骨组织RANKL mRNA表达减少、OPG mRNA表达增加(P均＜0.05)，且假手术组和骨碎补总黄酮治疗组之间比较差异有统计学意义(P＜0.05)；(3)与模型组比较，假手术组和骨碎补总黄酮治疗组大鼠骨组织P-JNK、c-Fos表达降低(P均＜0.05)，但这两组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。结论骨碎补总黄酮可增加去卵巢大鼠骨密度，其途径可能是通过调节RANKL-OPG平衡、抑制JNK磷酸化及c-Fos表达实现的。

骨碎补总黄酮；骨质疏松；MAPK信号通路

骨质疏松(Osteoporosis，OP)是以低骨量及骨组织微结构退变为特征的一种全身性代谢性破坏性骨疾病，其临床上常伴有骨脆性增加、骨强度降低，易发生骨折[1]，是常见的老年性疾病之一，近几年由于社会的发展和人口的老龄化，OP的发病率逐年上升，据我国流行病学调查报告，骨质疏松症50~60岁发病率为21%，60~70岁发病率为58%，70~80岁发病率为100%。尤其是绝经后妇女，由于绝经后雌激素水平降低导致骨质疏松症和骨折并发症发病率远远高于男性[2]。防治绝经后骨质疏松症的主要方法是雌激素替代疗法，但临床中发现其容易引起癌变及其他的副作用。近年来，国内外科学家关注一组来源于植物，被命名为植物雌激素，在人体内具有雌激素样作用的化合物，这些化合物主要包括金雀异黄素、骨碎补总黄酮、葛根异黄酮、丹参酮等。这一类化合物的化学结构与雌激素非常相似，其可发挥拟雌激素或抗激素效应。骨碎补总黄酮(Total flavonoids of rhizoma drynariae，TFRD)是骨碎补的主要有效成分，其具有类似于植物雌激素的作用，而且毒副作用低微，可作为雌激素的替代品长期服用，避免了雌激素的致癌作用，值得深入研究探讨。为了研究骨碎补总黄酮治疗OP的作用机制，本次实验观察了骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠RANKL/OPG平衡及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的影响，探讨骨碎补总黄酮防治OP的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用6个月龄清洁级、SD大鼠，45只，雌性，体重为180 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司[许可证号：SCXK(湘)2009-0012]。

1.2 主要试剂及仪器 TFRD(北京歧黄制药有限公司，国药准字220030008，批号：090601。每1 g提取物相当于生药66.7 g)；大鼠血清核因子κB受体活化因子配体(RANKL)；兔抗大鼠翼式转录因子氨基末端激酶(JNK)；BCA-100蛋白定量检测试剂盒(由上海申能博彩生物科技有限公司提供)；磷酸化的JNK(P-JNK)、细胞外调节激酶(ERK)、SYBRROPremix Ex TaqTM荧光定量试剂盒、反转录试剂盒(购自大连宝生物有限公司)；p38丝裂原活化蛋白激酶(p38)、磷酸化的细胞外调节蛋白激酶(P-ERK)、磷酸化的Pp丝裂原活化蛋白激酶(P-p38)、c-Fos、兔抗大鼠GAPDH抗体、骨保护素(OPG)ELISA检测试剂盒(均购自武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3 实验分组 大鼠分笼饲养，自由摄取标准饲料，饮用自来水，适应性饲养一周后按随机数字表法将45只大鼠随机分为假手术组15只、手术组30只。假手术组大鼠行腹腔手术找到卵巢，但不切除，手术组大鼠行双侧卵巢切除术。所有动物饲养12周后检测BMD，以确定OP动物模型复制成功是否，若成功后即将30只手术组大鼠再随机分为模型组15只、骨碎补总黄酮给药组15只。

1.4 制作OP模型 OP模型制做参照文献中的方法[3-4]，切除双侧卵巢制作大鼠OP模型。将称重后的各组大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)，行全身麻醉后取仰卧位，固定后进行腹部剃毛并消毒，沿下腹部正中腹白线作纵行切口(切口长度2~3 cm)，打开腹腔后即切除双侧卵巢，术后切口用75%酒精棉球消毒。假手术组亦打开腹腔，但不切除卵巢。术后为预防感染各组大鼠腹腔注射10万单位青霉素，3 ml/只，1次/d，连续3 d。术后第12周，手术组和假手术组大鼠行全身麻醉后应用双能X线骨密度仪测定左右股骨BMD。

1.5 给药方法及标本采集 模型复制成功后，给药组大鼠用骨碎补总异黄酮灌胃(50 mg/kg)。将药物稀释成1.0 ml/100 g体重(5 mg/ml)后即进行灌胃，1次/d(灌胃前12 h应禁食不禁水，持续12周)。同时假手术组和模型组用等量生理盐水灌胃。灌胃12周后处死大鼠，腹腔内注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)，心脏采血，离心后取血清，置-20℃备用。再依次灌注生理盐水(200~250 ml)、4%多聚甲醛(350~400 ml)。灌注完以上液体即取左侧股骨，截取左下肢1 cm骨组织，用DEPC水处理后，密封包裹保存于液氮中；取出右侧股骨，在4℃条件下用4%多聚甲醛固定24 h。

1.6 大鼠血清RANKL、OPG含量检测 血清RANKL、OPG含量测定采用ELISA法，按试剂盒说明书进行操作。

1.7 大鼠骨组织RANKL、OPG mRNA表达检测 引物的设计以管家基因(GAPDH)为对照，大连宝生物有限公司合成，RT-PCR方法见参考文献[5]，见表1。

表1 PCR中应用的引物序列

1.8 大鼠骨组织P-JNK、P-P38、P-ERK、c-Fos蛋白表达 将上述左下肢骨组织充分匀浆后加入0.5 ml RIPA裂解液后提取蛋白，用Western blot法测定蛋白表达，上样，电泳，200 mA转膜1 h后进行如下操作，先加一抗，室温下孵育过夜，再加二抗，室温下孵育，后化学发光、成像分析系统曝光。

1.9 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠左、右股骨BMD变化 手术12周后，与假手术组比较，手术组大鼠左、右股骨BMD值降低(P＜0.05)，这说明手术组大鼠的骨量明显丢失，同时提示OP模型复制成功，见表2。

表2 手术12周时两组大鼠左股骨、右股骨BMD值结果比较(±s，g/cm2)

表2 手术12周时两组大鼠左股骨、右股骨BMD值结果比较(±s，g/cm2)

15 15手术组假手术组t值P值0.212±0.009 0.289±0.007 -26.156＜0.001 0.228±0.002 0.282±0.006 -33.068＜0.001

2.2 各组大鼠血清RANKL、OPG含量变化 给药结束后，与假手术组大鼠比较，模型组大鼠骨组织RANKL含量增加(P＜0.05)，而OPG含量减少(P＜0.05)，RANKL/OPG比值明显增大(P＜0.05)；与模型组比较，骨碎补总黄酮给药组大鼠骨组织RANKL含量减少(P＜0.05)，而OPG含量增加(P＜0.05)，RANKL/ OPG比值亦减小(P＜0.05)，见表3。

2.3 各组大鼠骨组织RANKL、OPG mRNA表达变化 RT-PCR检测表明，与假手术组大鼠比较，模型组及骨碎补总黄酮给药组大鼠骨组织RANKL mRNA的表达增加(P＜0.05)，OPG mRNA表达减少(P＜0.05)，与模型组比较，骨碎补总黄酮给药组大鼠骨组织RANKL mRNA的表达明显减少(P＜0.05)，而OPG mRNA表达增加(P＜0.05)，见表4。

表3 各组大鼠血清RANKL、OPG含量变化(±s)

表3 各组大鼠血清RANKL、OPG含量变化(±s)

注：a与假手术组比较，P<0.05，b与模型组比较，P<0.05.

组别模型组假手术组骨碎补总黄酮给药组F值P值只数15 15 15 RANKL(PB：pg/ml) 81.820±1.500a15.300±0.540 25.600±1.100b15376.817＜0.001 OPG(PB：pg/ml) 241.01±10.580a381.400±10.240 365.290±11.530b759.455＜0.001 RANKL/OPG 0.340±0.010a0.042±0.001 0.072±0.009b6656.374＜0.001

表4 各组大鼠骨组织RANKL、OPG mRNA的表达(±s)

表4 各组大鼠骨组织RANKL、OPG mRNA的表达(±s)

注：a与假手术组比较，P<0.05，b与模型组比较，bP<0.05.

组别模型组假手术组骨碎补总黄酮给药组F值P值只数15 15 15 RANKL(PB：pg/ml) 5.10±0.10a1.02±0.08 3.2±1.16b137.714＜0.001 OPG(PB：pg/ml) 1.01±0.04a0.23±0.01 0.80±0.03b2819.423＜0.001

2.4 骨碎补总黄酮对大鼠骨组织MAPK信号通路的影响 治疗12周后，Western blot结果显示，与假手术组相比较，模型组大鼠骨组织P-JNK蛋白表达亦增加(P＜0.05)，见图1；c-Fos蛋白表达增加(P＜0.05)，见图2；与模型组比较，骨碎补总黄酮治疗组大鼠骨组织P-JNK和c-Fos蛋白表达均减少(P＜0.05)；各组大鼠P-p38、P-ERK蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05)，见图3和图4。

图1P-JNK蛋白表达

图2 c-Fos蛋白表达

图3 P-p38蛋白表达

图4P-ERK蛋白表达

3 讨论

OP的临床表现主要为患者骨量明显下降，易发骨折，同时可能还伴有严重的骨痛，其主要是由骨重建高转换而引起的。骨重建的过程包括破骨细胞(OC)激活后与相耦联的成骨细胞(OB)激活骨形成终结这两个过程。肿瘤坏死因子超家族成员中的RANKL、核因子κB受体活化因子(RANK)和OPG通过对OC和OB之间的耦联关系调节骨转换的速度[6]。目前已知OC生成所必需的细胞因子是RANKL和巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)[7]。OPG是OB谱系中各种细胞产生的一种糖蛋白，OPG的N末端与RANK结构相似，其作用是与RANKL结合后抑制RANKL与RANK的结合，进而抑制前体OC分化、生存与活化，促进成熟OC的凋亡，阻断信号连接[8]。骨重建中起重要调节作用的是由RANKL、RANK、OPG组成的RANKL-RANK-OPG系统。RANKL/OPG值的变化受骨形成与骨吸收状态的影响，OC诱导分化的决定性因素[9]；有研究表明阻断RANKL与RANK结合，降低RANKL/OPG比值即可抑制OC的分化、生存与活化，从而起到防治骨质疏松的作用[10]。

在本研究中检测大鼠骨组织中RANKL mRNA、OPG mRNA和这两个指标的蛋白表达水平，与假手术组相比，均出现模型组大鼠OPG含量降低(P＜0.05)，而RANKL含量增高(P＜0.05)，RANKL/OPG比值升高(P＜0.05)，这是由于卵巢被切除后缺乏雌激素，出现OC的分化、成熟、活化，从而导致骨丢失加快，骨吸收增加，以致引起上述指标的变化。骨碎补总黄酮治疗12周后，血清中OPG含量增多(P＜0.05)，RANKL含量降低(P＜0.05)，RANKL/OPG比值变低(P＜0.05)，提示骨碎补总黄酮可能通过减小RANKL/ OPG的比值，抑制OC分化、成熟、活化，抑制OC的骨吸收，从而起到治疗骨质疏松的作用。

MAPK信号通路主要包括p38、ERK、JNK 3条。其中ERK通路包括ERK1和ERK2，分子量分别为44和42，因此该通路又名P42/44[11]。它是RANKL-RANK-OPG系统向下游传递信号的主要途径。研究表明RANKL与RANK结合后可进一步激活MAPK家族的信号通路(JNK、ERK、p38)，进而激活转录因子-活化蛋白1(AP-1)，将RANKL的信号传递下去[12]。AP-1的主要组成部分之一是c-Fos，c-Fos在OC分化中发挥重要的作用。

在骨碎补总黄酮治疗12w后检测大鼠骨组织MAPK家族(JNK、P38、ERK)及MAPK下游转录因子c-Fos的表达，发现骨组织中p-38、P-ERK水平低，P-p38/总p38无明显改变，P-ERK/总ERK比值亦无显著改变，说明去卵巢大鼠在骨碎补总黄酮治疗12周后p38和ERK未被激活。而与假手术组相比，模型组大鼠骨组织P-JNK/总JNK比值增大，P-JNK水平增高(P＜0.05)，说明模型组大鼠JNK蛋白已被激活，由此说明，骨碎补总黄酮可降低P-JNK/总JNK比值(P＜0.05)。同样，与假手术组比较，模型组大鼠骨组织c-Fos蛋白表达水平增高(P＜0.05)，骨碎补总黄酮均使c-Fos的表达降低(P＜0.05)。以上结果表明，骨碎补总黄酮可能通过抑制下游的转录因子c-Fos和JNK蛋白，通过这种途径调控OC的分化、成熟与活化。

本研究结果表明骨碎补总黄酮能提高去卵巢大鼠骨密度，其作用机制可能是通过调节RANKL-OPG平衡及抑制P-JNK和c-Fos表达而实现的，其机制值得进一步的研究探讨。

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Effects of drynaria total flavonoids on RANKL/OPG balance and MAPK signaling pathways in overiectomized rats.

ZHU Zhen-biao,LIN Zhi-bing,DING Xiao-li,LIU Yi-heng.Department of Orthopaedics,Haikou People's Hospital,Haikou 570208,Hainan,CHINA

ObjectiveTo explore the effect of drynaria total flavonoids on receptor activator of nuclear factor kappa B ligand(RANKL)/Osteoprotegerin(OPG)expression and mitogen-activated protein kinase(MAPK)signaling pathways in ovariectomized rats.MethodsForty-five female rats were divided into sham operation group(15 rats)and operation group(30 rats).The rats in operation group all underwent ovariectomy and had bone mineral density(BMD)detected 12 weeks later.After confirming the success of OP,the rats in operation group were divided into drynaria total flavonoids group and model group,with 15 rats in each group.The drynaria total flavonoids group was treated with drynaria total flavonoids solution,while the model group and sham operation group received gastric perfusion of normal saline.The duration of treatment was 12 weeks.The level of BMD was checked.The expression of RANKL,OPG was detected by ELISA.The expression of RANKL and OPG mRNA of femur was detected by RT-PCR.Western blotting analysis was used to examine the phosphorylation of c-Jun Ntermingal kinase(JNK), MAPK p38,extracellular-regulated kinase ERK,and c-FOS protei expression in bone tissues.Results(1)Compared with sham operation group,after 12-week treatment,the BMD in model group were significantly lower(P＜0.05).The serum RANKL level increased significantly,serum OPG level decreased significantly,and the RANKL/OPG ratio increased significantly(allP＜0.05).The RANKL mRNA expression significantly increased and OPG mRNA decreased significantly in bone tissues(allP＜0.05).(2)Compared with model group,BMD was higher than that of rats in sham operation group and drynaria total flavonoids group(allP＜0.05).The serum RANKL level decreased significantly, and the serum OPG level increased significantly,with the RANKL/OPG ratio decreased significantly(allP＜0.05). The RANKL mRNA expression decreased significantly and OPG mRNA increased significantly in bone tissues(allP＜0.05).There were significant differences among sham operation group and drynaria total flavonoids group(P＜0.05). (3)Compared with model group,bone tissue P-JNK and c-Fos expression in rats in sham operation group and drynariatotal flavonoids group were lower,but there were no significant differences among sham operation group and drynaria total flavonoids group(P＞0.05).ConclusionDrynaria total flavonoids group can improve the BMD values in ovariectomized rats,which may be related to its function in regulating the balance of RANKL/OPG and inhibiting the expression of JNK phosphorylation and c-Fos.

Drynaria total flavonoids;Osteoporosis;MAPK signaling pathways

R-332

A

1003—6350（2015）09—1249—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.09.0450

2014-11-12)

海南省自然科学基金（编号：811156）；海南省卫生厅资助项目（编号：琼卫2010-69）

刘亦恒。E-mail:arosezxr@163.com