电针内关穴对大鼠体外循环后心肌细胞超微结构和线粒体通透性转运孔的影响

涂 杰，梁东科，刘国锋，刘菊梅，梁蓓薇，韦秋英，张炳东

(广西医科大学第一附属医院心血管病研究所手术麻醉室，广西 南宁 530021)

电针内关穴对大鼠体外循环后心肌细胞超微结构和线粒体通透性转运孔的影响

涂 杰，梁东科，刘国锋，刘菊梅，梁蓓薇，韦秋英，张炳东

(广西医科大学第一附属医院心血管病研究所手术麻醉室，广西 南宁 530021)

目的 探讨电针(EA)内关穴对大鼠体外循环(CPB)后心肌细胞超微结构和线粒体通透性转运孔(MPTP)的影响。方法成年雄性SD大鼠75只，随机分为五组(n=15)：假手术组(S组)、CPB组、CPB+EA组、CPB+苍术苷组(CPB+Atr组)和CPB+EA+苍术苷组(CPB+EA+Atr组)。采用尾动脉插管灌注，右颈静脉插管引流建立CPB模型。S组仅行麻醉和动静脉插管；CPB组行CPB 2 h；CPB+EA组行CPB 2 h且在CPB期间使用电针刺激双侧内关穴；CPB+Atr组在CPB开始时静脉注射苍术苷5 mg/kg，随后处理方法同CPB组；CPB+EA+Atr组在CPB开始时静脉注射苍术苷5 mg/kg，随后处理方法同CPB+EA组。麻醉复苏后2 h，取右股动脉血测定心肌肌钙蛋白I(cTnI)浓度和肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性；取左心室心肌组织，电镜观察心肌细胞超微结构，行线粒体损伤评分，并用差速离心法分离线粒体，测定线粒体内Ca2+浓度和MPTP活性。结果与S组比较，其余各组血浆cTnI浓度和CK-MB活性升高，心肌细胞超微结构损伤较重，线粒体损伤评分增加，线粒体内Ca2+浓度和MPTP活性升高(P＜0.05)；与CPB组比较，CPB+EA组和CPB+EA+Atr组cTnI浓度和CK-MB活性降低，心肌细胞超微结构损伤较轻，线粒体损伤评分下降，线粒体内Ca2+浓度和MPTP活性降低(P＜0.05)。苍术苷可抑制电针内关穴对心肌的保护作用(P＜0.05)。结论电针内关穴可减轻大鼠体外循环后心肌细胞超微结构损伤，其机制可能与抑制线粒体内钙超载和减少MPTP的开放有关。

电针；内关穴；体外循环；线粒体损伤；线粒体通透性转换孔

体外循环(Cardiopulmonary bypass,CPB)过程中手术操作引起的直接损伤、循环管路与血液接触激活的全身炎症反应以及心脏停跳复跳所致的缺血再灌注损伤等因素，均可导致术后发生不同程度的心肌损伤[1]。内关穴属手厥阴心包经，素有“内关主刺气快攻，兼炙心胸肋痛疼”的古训，大量基础和临床研究[2-4]证实电针(Electroacupuncture，EA)内关穴具有明显的心肌保护作用，但其具体机制仍不清楚。本研究拟观察电针内关穴对大鼠体外循环后心肌细胞超微结构和线粒体通透性转运孔的影响，并初步探讨其发挥心肌保护作用的机理。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 多功能监测仪(日本光电公司)，动物膜式氧合器(东莞科威医疗器械有限公司)，双头滚压泵(德国Stockert公司)，多用电子穴位治疗仪(上海华谊仪器公司)，透射电镜(日本JEOL公司)，紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，线粒体提取试剂盒(南京建成生物工程研究所)，二氨基联苯胺蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，苍术苷(Sigma公司，美国)，Ca2+浓度试剂盒(福州迈新生物科技有限公司)。

1.2 实验动物与分组 本动物实验经广西医科大学动物委员会批准，并符合国家科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。清洁级健康雄性SD大鼠75只，4～6个月龄，体重320～420 g，由广西医科大学实验动物中心提供。采用随机数字表法，将75只大鼠随机分为五组：假手术组(S组)、CPB组、CPB+ EA组、CPB+苍术苷组(CPB+Atr组)和CPB+EA+苍术苷组(CPB+EA+Atr组)，每组15只。S组仅于麻醉诱导后行机械通气和各部位插管，不行CPB；CPB组行CPB 2 h；CPB+EA组行CPB 2 h，且在CPB期间使用电针刺激双侧内关穴；CPB+Atr组在CPB开始时静脉注射苍术苷5 mg/kg，随后处理方法同CPB组；CPB+ EA+Atr组在CPB开始时静脉注射苍术苷5 mg/kg，随后处理方法同CPB+EA组。

1.3 CPB模型制备 参照文献[5]制作大鼠体外循环模型。腹腔注射10%乌拉坦10 ml/kg麻醉，16 G静脉导管行气管插管后机械通气，潮气量3 ml/kg，呼吸频率60次/min。经右颈总动脉插入双腔球囊扩张导管(球囊直径3.5 mm)至大鼠升主动脉根部，以备主动脉阻断和心肌停跳液灌注。采用尾动脉插管灌注，右颈静脉插管引流建立CPB。无血预充，灌注流量约为每分钟100 ml/kg。CPB开始后即逐渐降温，15 min后大鼠鼻温接近32℃，充气升主动脉内双腔球囊扩张导管套囊，阻断升主动脉，并灌注St.ThomasⅡ型心肌停跳液15 ml/kg，使心脏停跳。在心脏停跳15 min后逐渐复温，并于心脏停跳30 min时套囊放气，开放升主动脉，恢复心脏供血，以使心脏复跳。CPB转流2 h后逐渐减少灌注流量，在心率血压稳定的情况下结束体外循环。待自主呼吸恢复平稳后停止机械通气，拔除气管导管，并密切观察大鼠麻醉复苏后生命体征，2 h后颈椎脱臼处死大鼠。

1.4 电针方法 内关穴定位参考文献[2]，位于尺桡骨缝间，距腕关节约3 mm处。在CPB开始后，取大鼠双侧内关穴，用0.3 mm×15 mm毫针刺入皮下2 mm，接电针仪，疏密波，频率2 Hz/15 Hz，强度1 mA，CPB结束时拔针。

1.5 血浆心肌肌钙蛋白I(cTnI)浓度和肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性的检测 麻醉复苏后2 h，从大鼠右股动脉插管处取血，离心，取上清液，用全自动生化分析仪检测cTnI浓度和CK-MB活性。

1.6 电镜观察心肌细胞超微结构和心肌线粒体损伤评分 麻醉复苏后2 h，将大鼠颈椎脱臼处死，剖胸取左心室心肌组织，固定包埋切片后，于透射电镜下观察心肌细胞超微结构，并行心肌线粒体损伤评分，评分方法参考文献[6]。

1.7 线粒体内Ca2+浓度检测 用差速离心法提取心肌线粒体后，将线粒体用20倍的预冷匀浆溶液制成混悬液，按照Ca2+试剂盒的使用说明，用比色法测定Ca2+浓度。

1.8 线粒体通透性转运孔(Mitochondrial permeability transition pore，MPTP)活性测定 参照Jie等[7]的方法，用紫外分光光度计连续测定线粒体混悬液在540 nm处的吸光值，每30 s测定1次，持续6 min。以第1次测定值为参照值，其余时点的测定值与之相比，所得比值即为相对吸光度值(A540)，用最大A540值与最小A540值的差值表示MPTP活性，从而反映其开放水平。

1.9 统计学方法 采用SPSS15.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况 S组大鼠全部顺利完成试验；CPB组有2只大鼠因CPB后心功能衰竭死亡；CPB+ EA组有1只大鼠因CPB后心律失常死亡;CPB+Atr组有1只大鼠因心脏复跳失败死亡；CPB+EA+Atr组有1只大鼠因CPB后心功能衰竭死亡，1只大鼠因心脏复跳失败死亡。

2.2 各组大鼠血浆cTnI浓度和CK-MB活性的比较 与S组比较，其余各组血浆cTnI浓度和CK-MB活性升高(P＜0.05)；与CPB组比较，CPB+EA组和CPB+EA+Atr组cTnI浓度和CK-MB活性下降(P＜0.05)，CPB+Atr组血浆cTnI浓度和CK-MB活性升高(P＜0.05)；与CPB+EA组比较，CPB+EA+Atr组 cTnI浓度和CK-MB活性升高(P＜0.05)，见表1。

2.3 各组大鼠心肌组织超微结构的观察 S组心肌纤维排列规整，各带明显，各细胞器未见异常；CPB组心肌纤维排列紊乱，肌节结构不清，线粒体肿胀，内有空泡形成，嵴断裂；CPB+EA组心肌纤维排列略紊乱，线粒体轻微肿胀，少量嵴断裂。CPB+Atr组心肌纤维排列明显紊乱，线粒体明显肿胀，内有大量空泡形成，嵴丢失；CPB+EA+Atr组心肌纤维排列紊乱，线粒体略水肿，峭断裂，见图1。

2.4 各组大鼠线粒体损伤评分、线粒体内Ca2+浓度和MPTP活性的比较 与S组比较，其余各组线粒体损伤评分增加，线粒体内Ca2+浓度和MPTP活性升高(P＜0.05)；与CPB组比较，CPB+EA组和CPB+EA+ Atr组线粒体损伤评分下降，线粒体内Ca2+浓度和MPTP活性降低(P＜0.05)，CPB+Atr组线粒体损伤评分增加，线粒体内Ca2+浓度和MPTP活性升高(P＜0.05)；与CPB+EA组比较，CPB+EA+Atr组线粒体损伤评分增加，线粒体内Ca2+浓度和MPTP活性升高(P＜0.05)，见表1。

表1 各组大鼠cTnI、CK-MB、线粒体损伤评分、Ca2+浓度和MPTP活性的比较(±s)

表1 各组大鼠cTnI、CK-MB、线粒体损伤评分、Ca2+浓度和MPTP活性的比较(±s)

注：与S组比较，aP＜0.05；与CPB组比较，bP＜0.05;与CPB+EA组比较，cP＜0.05。

S组CPB组CPB+EA组CPB+Atr组CPB+EA+Atr组F值P值0.042±0.009 0.092±0.026a0.050±0.013ab0.097±0.022ab0.062±0.017abc4.231 0.000 20 18 19 19 18 0.02±0.01 4.73±0.67a1.58±0.26ab4.86±0.73ab2.85±0.33abc17.661 0.000 11.7±2.4 57.3±13.7a32.7±11.3ab62.6±14.2ab43.8±12.5abc28.125 0.000 0.73±0.20 2.88±0.85a1.46±0.53ab3.17±0.86ab1.82±0.64abc8.424 0.000 0.51±0.08 4.84±1.26a2.68±1.13ab5.33±1.47ab3.47±1.06abc12.253 0.000

图1 各组大鼠心肌组织超微结构的观察(醋酸铀-柠檬酸铅双染色，×20 000)

3 讨 论

本研究采用尾动脉插管灌注，右颈静脉插管引流的方法建立大鼠CPB模型，实现了接近生理的全流量灌注，同时经右颈总动脉插入双腔球囊扩张导管至升主动脉根部，充气阻断主动脉，灌注心肌停跳液使心脏停跳，从而在最大程度上模拟了CPB造成的心肌缺血再灌注损伤，为研究心脏手术中心肌损伤提供了可靠的动物模型。大量基础和临床研究[2-4]证实电针内关穴对心肌缺血再灌注损伤有一定的保护作用，因此本研究选用内关穴作为刺激穴位，内关穴的定位和刺激方法参照文献[2]。苍术苷是MPTP特异性开放剂，本研究参照预试验结果和文献[8]，选择在CPB开始时静脉注射苍术苷5 mg/kg。

心肌细胞超微结构的变化可直接反映心肌细胞损伤的程度[9]。当心肌发生缺血缺氧性损伤时，其亚细胞结构可发生改变，以线粒体的改变最为显著，表现为线粒体水肿、峭断裂和空泡化等，Dadabayev等[10]认为维持线粒体结构的完整性，是心肌细胞能量代谢顺利进行的最基本条件。本研究发现，与S组比较，CPB组和CPB+EA组心肌细胞超微结构出现不同程度的损伤，但CPB+EA组心肌线粒体损伤评分均明显低于CPB组，从形态学上证实了电针内关穴可保持心肌线粒体膜和空间结构的完整性，有利于减轻CPB后心肌细胞的损伤。

cTnI和CK-MB是评价心肌细胞损伤程度的常用指标，有较高的特异性和敏感性[11]。本研究结果表明，与S组比较，CPB组和CPB+EA组cTnI浓度和CK-MB活性明显升高，说明CBP可造成一定程度的心肌细胞损伤，其机制可能与体外循环管路和血液接触激活的全身炎性反应、心脏停跳复跳所致的心肌缺血再灌注损伤等因素有关；而CPB+EA组cTnI浓度和CK-MB活性明显低于CPB组，从分子生物学上证实了电针内关穴对大鼠CBP后的心肌保护作用是明显的。

线粒体不仅是细胞的能量代谢中心，同时也是细胞Ca2+的缓冲器，具有摄取和释放Ca2+的能力，对维持胞浆内Ca2+的稳态起重要作用[10]。CPB所致的全身炎性反应、氧化应激反应和缺血再灌注损伤等伤害性因素，可引起细胞膜上的Ca2+通道蛋白变构，使细胞外Ca2+内流增加，导致胞浆内钙超载；胞浆内高浓度的Ca2+使线粒体摄取Ca2+增加，导致线粒体内形成磷酸钙沉积，引起氧化磷酸化过程障碍，细胞能量代谢发生障碍，导致细胞损伤发生[12]。本研究结果显示，与S组比较，CPB组和CPB+EA组线粒体内Ca2+浓度明显升高，说明大鼠CPB后线粒体内发生了钙超载，这与Drabek等[13]研究一致。而CPB+EA组线粒体内Ca2+浓度明显低于CPB组，提示电针内关穴的心肌保护作用可能与抑制线粒体内钙超载有关。

近年有研究表明线粒体凋亡是CPB后心肌细胞损伤的最主要形式，而线粒体凋亡通路的分子基础是MPTP的开放[12]。MPTP是位于线粒体膜上的多蛋白复合体，在维持线粒体膜电位、保护线粒体结构和功能方面具有重要作用[14]。生理状态下，MPTP关闭，当受到伤害性因素刺激时(如缺血缺氧、氧化应激等)，MPTP异常开放，大量水和无机离子进入线粒体，导致线粒体肿胀、嵴断裂、空泡化，同时细胞色素C通过MPTP释放到胞浆中，激活一系列凋亡蛋白酶，导致细胞凋亡[14]。因此，大量研究已将抑制MPTP的开放作为心肌保护中的新策略。本研究发现，CPB+EA组心肌细胞MPTP的开放程度明显低于CPB组，但是，与CPB+EA组比较，CPB+EA+Atr组血浆cTnI浓度和CK-MB活性升高，心肌线粒体损伤评分增加，表明给予MPTP特异性开放剂苍术苷后，电针内关穴的心肌保护作用被拮抗，因而，我们推测电针内关穴的心肌保护作用还可能与减少MPTP的开放程度有关。

综上所述，电针内关穴可减轻大鼠体外循环后心肌细胞超微结构损伤，其机制可能与抑制线粒体内钙超载和减少MPTP的开放有关，其临床应用前景可观。

[1]Kortekaas KA,van der Baan A,Aarts LP,et al.Cardiospecific sevoflurane treatment quenches inflammation but does not attenuate myocardial cell damage markers:a proof-of-concept study in patients undergoing mitral valve repair[J].Br J Anaesth,2014,112 (6):1005-1014.

[2]钟 敏,杨进辉,招伟贤,等.阿片受体介导电针预适应对心脏的保护作用[J].广东医学,2011,32(6):685-687.

[3]Yang L,Yang J,Wang Q,et al.Cardioprotective effects of electroacupuncture pretreatment on patients undergoing heart valve replacement surgery:a randomized controlled trial[J].Ann Thorac Surg,2010,89(3):781-786.

[4]王祥瑞,卢中平,王震虹,等.针刺辅助低温对CABG术后缺血再灌注心肌的保护作用[J].实用医学杂志,2005,21(20):2248-2251.

[5]Samarska IV,Henning RH,Buikema H,et al.Troubleshooting the rat model of cardiopulmonary bypass:effects of avoiding blood transfusion on long-term survival,inflammation and organ damage [J].J Pharmacol Toxicol Methods,2013,67(2):82-90.

[6]Chen JF,Liu H,Ni HF,et al.Improved mitochondrial function underlies the protective effect of pirfenidone against tubulointerstitial fibrosis in 5/6 nephrectomized rats[J].PLoS One,2013,8(12): e83593.

[7]Jie B,Zhang X,Wu X,et al.Neuregulin-1 suppresses cardiomyocyte apoptosis by activating P13K/Akt and inhibiting mitochondrial permeability transition pore[J].Mol Cell Biochem,2012,370(1-2): 35-43.

[8]Wu L,Shen F,Lin L,et al.The neuroprotection conferred by activating the mitochondrial ATP-sensitive K+channel is mediated by inhibiting the mitochondrial permeability transition pore[J].Neurosci Lett,2006,402(1-2):184-189.

[9]Kanzaki Y,Yamauchi Y,Okabe M,et al.Three-dimensional architecture of cardiomyocytes and connective tissues in hypertrophic cardiomyopathy:a scanning electron microscopic observation[J].Cir-culation,2012,125(5):738-739.

[10]Dadabayev AR,Yin G,Latchoumycandane C,et al.Apolipoprotein A1 regulates coenzyme q10 absorption,mitochondrial function,and infarct size in a mouse model of myocardial infarction[J].J Nutr, 2014,144(7):1030-1036.

[11]阳 诺,马 辉,冼 磊,等.依达拉奉在体外循环术中的心肌保护作用[J].海南医学,2014,25(8):1111-1113.

[12]Lee GH,Lee HY,Li B,et al.Bax inhititor-1-mediated inhibition of mitochondrial Ca2+intake regulates mitochondrial permeability transition pore opening and cell death[J].Sci Rep,2014,4:5194.

[13]Drabek T,Janata A,Jackson EK,et al.Microglial depletion using intrahippocampal injection of liposome-encapsulated clodronate in prolonged hypothermic cardiac arrest in rats[J].Resuscitation, 2012,83(4):517-526.

[14]Correa F,Soto V,Zazueta C,et al.Mitochondrial permeability transition relevance for apoptotic triggering in the post-ischemic heart [J].Int J Biochem Cell Biol,2007,39(4):787-789.

Effect of electroacupuncture at Neiguan point on myocardial ultrastructure and mitochondrial permeability transition pore in rats undergoing cardiopulmonary bypass.

TU Jie,LIANG Dong-ke,LIU Guo-feng,LIU Ju-mei, LIANG Bei-wei,WEI Qiu-ying,ZHANG Bing-dong.Operation&Anesthesia Room,Institute of Cardiovascular Disease, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of electroacupuncture at Neiguan point(EA)on myocardial ultrastructure and mitochondrial permeability transition pore(MPTP)in rats undergoing cardiopulmonary bypass (CPB).MethodsSeventy-five adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups(n=15 each): sham operation group(group S),group CPB,group CPB+EA,CPB+infuse atractyloside group(group CPB+Atr),and CPB+EA+infuse atractyloside group(group CPB+EA+Atr).Tail arteries and right jugular vein were cannulated for CPB.Rats in group S were anaesthetized and cannulated;rats in group CPB were subjected to CPB for 2 h;rats in group CPB+EA were subjected to CPB for 2 h and electro-acupunctured at Neiguan point during CPB;rats in group CPB+Atr and group CPB+EA+Atr were infused atractyloside 5 mg/kg at the beginning of CPB.Blood samples were taken from right femoral artery at 2 h after anesthesia resuscitation for determination of plasma cardiac troponin I(cT-nI)concentration and creatine kinase-MB(CK-MB)activity,and those animals were sacrificed to obtain the myocardial specimens from left ventricle.Electron microscope was used to observe the changes of mitochondrial ultrastructure, and the severity of mitochondria injury was scored.Mitochondria fractions were isolated by differential centrifugation to test the concentration of Ca2+and MPTP opening degree.ResultsCompared with group S,the plasma concentrations of cTnI and activity of CK-MB were significantly higher,the damage of myocardial ultrastructure was aggravated,the score of mitochondrial injury,the concentration of Ca2+in mitochondrial and MPTP opening degree were significantly increased in other four groups(P＜0.05).Compared with group CPB,the plasma concentrations of cTnI and activity of CK-MB were significantly lower,the damage of myocardial ultrastructure was attenuated,the score of mitochondrial injury,the concentration of Ca2+in mitochondrial and MPTP opening degree were significantly decreased ingroup CPB+EA and group CPB+EA+Atr(P＜0.05).However,the protective effects of EA were inhibited by atractyloside(P＜0.05).ConclusionElectroacupuncture at Neiguan point can reduce the damage of myocardial ultrastructure in rats undergoing CPB.The mechanism is closely related to inhibiting calcium overload in mitochondrial and decreasing MPTP opening.

Electroacupuncture;Neiguan;Cardiopulmonary bypass(CPB);Mitochondrial damage;Mitochondrial permeability transition pore(MPTP)

R-332

A

1003—6350（2015）10—1405—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.10.0504

2014-12-01)

广西壮族自治区自然科学基金(编号：2013GXNSFBA019124)

张炳东。E-mail：zbdong2007@163.com