丝裂霉素、吡柔比星和免疫调节剂联合灌注对膀胱癌患者血清及冲洗液中粘附分子、蛋白酶表达的影响

杨 渝，朱晓应，郭嘉祥

(中国人民解放军总医院第一附属医院泌尿外科，北京 100048)

丝裂霉素、吡柔比星和免疫调节剂联合灌注对膀胱癌患者血清及冲洗液中粘附分子、蛋白酶表达的影响

杨 渝，朱晓应，郭嘉祥

(中国人民解放军总医院第一附属医院泌尿外科，北京 100048)

目的 分析丝裂霉素、吡柔比星和免疫调节剂联合灌注对膀胱癌患者血清及冲洗液中粘附分子、蛋白酶表达的影响。方法选取2012年10月至2014年10月间在本院接受经尿道膀胱肿瘤电切术(TURBT)治疗的非肌性浸润性膀胱癌患者86例，其中接受丝裂霉素、吡柔比星膀胱灌注治疗者(对照组)和接受丝裂霉素、吡柔比星和免疫调节剂联合灌注治疗者(观察组)各43例。检测两组患者治疗后的血清及冲洗液中的粘附分子、蛋白酶表达情况。结果(1)血清粘附分子：观察组血清细胞粘附分子(CD44v6)、E-钙黏素(E-cadherin)、肝细胞粘附分子(hepaCAM)水平高于对照组，上皮特异性粘附分子(EpCAM)、可溶性细胞间粘附分子-1(sICAM-1)、可溶性血管黏附分子-1(sVCAM-1)水平低于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)；(2)冲洗液粘附分子：观察组冲洗液CD44v6、E-cadherin、hepaCAM水平高于对照组，EpCAM、sICAM-1、sVCAM-1水平低于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)；(3)蛋白酶：观察组血清及冲洗液中基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)水平低于对照组，半胱氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)水平高于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论丝裂霉素、吡柔比星和免疫调节剂联合灌注可以调节膀胱癌患者的粘附分子及蛋白酶表达，抑制侵袭转移能力、促进肿瘤细胞凋亡。

膀胱癌；免疫调节剂；粘附分子；蛋白酶

膀胱癌是泌尿系统最为常见的恶性肿瘤之一，其中70%以上患者的肿瘤类型为浅表性，即非肌层浸润型，多采用手术治疗。经尿道膀胱肿瘤电切术(TURBT)是治疗非肌层浸润型膀胱癌的首选方案，但是术后复发率高达60%以上。手术治疗后的膀胱癌患者多辅以化疗，最常见的为术后膀胱内灌注化疗药物，可以达到一定治疗效果但是会削弱患者免疫功能，导致肿瘤复发[1]。在膀胱化疗药物灌洗同时序贯加入免疫调节剂是在抑制肿瘤细胞活性同时提升患者免疫功能的最新方案，相关研究已经发现化疗药物与免疫调节剂的序贯膀胱内灌洗可以优化膀胱癌患者的治疗效果，但是具体机制未明[2]。本次研究主要分析丝裂霉素、吡柔比星和免疫调节剂联合灌注对膀胱癌患者血清及冲洗液中粘附分子、蛋白酶家族含量的影响，具体报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012年10月至2014年10月间在本院接受经尿道膀胱肿瘤电切术(TURBT术)治疗的非肌性浸润性膀胱癌患者86例作为研究对象，所有患者具有典型的尿频、尿急、尿痛等临床症状，且经膀胱镜及CT检查确诊。纳入标准：(1)首发的单发性肿瘤患者；(2)临床分期Ta、T1期，病理分级G1、G2级；(3)原发性膀胱癌未见远处转移；(4)不伴有其他肿瘤或者无法控制的严重泌尿系统感染；(5)患者及家属在了解研究过程后自愿签署知情同意书。按照随机数表法将所有入组患者分为两组各43例，对照组采用术后丝裂霉素、吡柔比星联合膀胱内灌注化疗，观察组采用术后丝裂霉素、吡柔比星和免疫调节剂联合灌注化疗。观察组患者中男性23例，女性20例，年龄43～76岁，平均(58.27±7.93)岁，临床分期中Ta期28例，T1期15例，病理分级中G1级30例，G2级13例；对照组患者中男性22例，女性21例，年龄45～78岁，平均(57.78±7.63)岁，临床分期中Ta期26例，T1期17例，病理分级中G1级29例，G2级14例。两组患者的基线资料比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 灌注方法 观察组患者接受丝裂霉素、吡柔比星和免疫调节剂联合膀胱内灌注化疗，具体如下：患者术后14 d或者尿液清澈后7 d进行膀胱内灌注化疗，灌注前3 h限制饮水，灌注实施前嘱患者排空尿液。将已经消毒的导尿管置入膀胱内，将40 mg的丝裂霉素(MMC)融入50 ml生理盐水中注入膀胱，一周后将80 mg的卡介苗(BCG)融入生理盐水中注入膀胱。化疗药物灌注入膀胱内每隔10 min更换一次体位，包括左侧、右侧、仰卧位，化疗药物在膀胱内保留2 h后排出。每周实施一次化疗，以4次为一个疗程，共灌注化疗两个疗程以上。对照组患者接受术后丝裂霉素、吡柔比星联合膀胱内灌注化疗，具体方法及疗程同观察组。

1.2.2 血清及冲洗液采集方法 灌洗疗程结束后当天，采集患者外周静脉血5 ml，离心机中以3 000 r/min的速度离心取上清，保存于-80℃中备用。冲洗液的留取同样在疗程结束后，将灌洗液排出并冲洗膀胱，留取冲洗液保存于-80摄氏度中备用。

1.2.3 指标检测方法 采用酶联免疫吸附法测定细胞粘附分子(CD44v6)、上皮特异性粘附分子(EpCAM)、E-钙黏素(E-cadherin)、肝细胞粘附分子(hepaCAM)、可溶性细胞间粘附分子-1(sICAM-1)、可溶性血管粘附分子-1(sVCAM-1)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、半胱氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)。

1.3 统计学方法 采用SPSS18.0软件录入和分析数据，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验、计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清粘附分子水平 观察组患者治疗后的血清CD44v6、E-cadherin、hepaCAM水平高于对照组，EpCAM、sICAM-1、sVCAM-1水平低于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 两组患者接受不同治疗方案后的血清黏附分子水平比较(±s，ng/L)

表1 两组患者接受不同治疗方案后的血清黏附分子水平比较(±s，ng/L)

组别观察组对照组t值P值CD44v6 76.28±11.05 40.61±7.23 6.493＜0.05 EpCAM 37.16±5.25 59.83±7.11 5.883＜0.05 E-cadherin 70.52±7.79 35.55±5.20 8.263＜0.05 hepaCAM 88.26±9.27 51.27±6.33 6.093＜0.05 sICAM-1 35.51±4.56 68.54±7.84 7.274＜0.05 sVCAM-1 60.56±7.78 104.82±14.28 8.273＜0.05

2.2 冲洗液粘附分子水平 观察组患者治疗后的冲洗液CD44v6、E-cadherin、hepaCAM水平高于对照组，EpCAM、sICAM-1、sVCAM-1水平低于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

2.3 蛋白酶水平 观察组患者治疗后的血清及冲洗液中MMP-2、MMP-9水平均低于对照组，Caspase-8水平高于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表2 两组患者接受不同治疗方案后的冲洗液黏附分子水平比较(±s，ng/L)

表2 两组患者接受不同治疗方案后的冲洗液黏附分子水平比较(±s，ng/L)

组别观察组对照组t值P值CD44v6 67.21±11.05 32.53±7.23 6.395＜0.05 EpCAM 31.37±5.16 52.76±7.05 6.621＜0.05 E-cadherin 61.51±7.73 29.29±5.15 7.364＜0.05 hepaCAM 72.15±9.55 36.26±6.17 8.394＜0.05 sICAM-1 35.39±4.21 60.73±7.73 7.214＜0.05 sVCAM-1 42.51±7.66 76.42±14.36 6.938＜0.05

表3 两组患者接受不同治疗方案后的蛋白酶水平比较(±s，ng/ml)

表3 两组患者接受不同治疗方案后的蛋白酶水平比较(±s，ng/ml)

组别血清冲洗液观察组对照组t值P值MMP-2 331.53±44.73 516.65±65.31 5.394＜0.05 MMP-9 376.28±41.83 509.72±68.52 6.098＜0.05 Caspase-8 203.48±32.18 95.38±10.38 7.332＜0.05 MMP-2 214.53±32.76 376.59±35.08 6.342＜0.05 MMP-9 301.77±33.62 421.68±56.73 6.894＜0.05 Caspase-8 163.28±16.32 68.37±7.83 6.774＜0.05

3 讨论

膀胱癌肿瘤侵犯膀胱壁范围一般远比临床所见广泛，故在临床治疗中膀胱癌组织被彻底切除的可能性较低，术后易复发。为了防止膀胱癌术后复发，通过尿道插入导尿管进行膀胱腔内化疗或者免疫治疗是目前应用最多的方法[3]。用于膀胱腔内灌注的化疗药物常用的有丝裂霉素、吡柔比星，常用的免疫调节剂是卡介苗(BCG)，BCG可以有效激活机体的免疫反应，使体内产生白介素-2(IL-2)及干扰素-γ(INF-γ)等淋巴因子，在增强机体免疫力的同时促进肿瘤细胞凋亡，最终提高抗肿瘤作用[4]。但是BCG的单独应用具有严重的不良反应，包括血尿、膀胱刺激、继发性免疫缺陷、尿道黏膜损伤等，使其临床应用受到极大限制。鉴于BCG的良好应用效果与较大的不良反应，诸多学者推荐将其与化疗药物组成序贯治疗方案，在避免BCG过度不良反应的基础上协同发挥两者作用。

细胞黏附分子CD44v6是一种细胞表面跨膜糖蛋白分子，定位于人类第11号染色体短臂上，由组成型及变异体外显子共同编码完成，有研究表明CD44v6与多种肿瘤发生及转移均关系密切，且随着移行细胞癌分化降低及浸润深度增加其表达逐步减弱[5]。可见CD44v6的表达可以造成癌细胞之间以及癌细胞与基底部的粘连，使得肿瘤不易脱落扩散，延缓肿瘤进展，故在膀胱移行细胞癌中CD44v6的表达情况与患者预后关系密切[6]。E-cadherin是一种钙依赖性细胞粘附分子，可以介导同型细胞连结、维持细胞正常形态的完整性，其表达缺失是上皮细胞-间质转化发生的标志，已经证实E-cadherin表达在人类诸多恶性上皮肿瘤中下降甚至缺失[7]。hepaCAM是最近发现的一种免疫球蛋白超家族类细胞粘附分子，其通过增强细胞-基质粘附、抑制细胞增殖能力而影响肿瘤的侵袭转移能力[7]。国内外研究已经证实hepaCAM表达异常与肝癌、乳腺癌、肾癌的基质粘附能力改变关系密切。上述研究结果显示经过联合膀胱灌洗后观察组患者的血清及冲洗液中CD44v6、E-cadherin、hepaCAM蛋白表达量均大幅增高，提示以上三种粘附分子均参与了膀胱癌肿瘤细胞的侵袭转移过程，而加入免疫调节剂进行联合膀胱灌洗有助于抑制肿瘤进展与扩散、降低肿瘤侵袭能力[8]。

EpCAM是由肿瘤相关钙信号转导基因编码的一个单次跨膜蛋白，参与β-连环蛋白依赖的Wnt级联反应，激活c-myc、cyclinA/E等原癌基因表达并产生致瘤作用[9]。目前已知EpCAM高表达于乳腺癌、卵巢癌等上皮性肿瘤组织中，作为肿瘤诊断及治疗指标受到越来越多关注。sICAM-1和sVCAM-1属于黏附分子免疫球蛋白超家族，其产生途径包括细胞内mRNA直接剪接变异体翻译、膜型分子经蛋白酶裂解后脱落两种[10]。sICAM-1与sVCAM-1在各种炎症免疫反应的监测及调控中发挥重要作用，同时在肿瘤生长转移过程中的细胞间连接中亦扮演重要角色，已经证实其在肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤患者的血清中表达增高。sICAM-1与sVCAM-1是肿瘤细胞膜表面抗原之一，对肿瘤的免疫应答产生一定作用，故其释放水平与肿瘤大小及肿瘤恶性程度均相关[11-12]。上述研究显示观察组患者接受联合灌洗治疗后的血清及冲洗液中的EpCAM、sICAM-1、sVCAM-1蛋白表达水平降低，提示加入免疫调节剂进行联合灌洗后可以增强宿主的免疫功能，尤其增强局部免疫监视能力，在遏制肿瘤的复发转移方面具有积极作用。

MMPs是一类锌离子依赖性蛋白酶家族，具有相似结构及氨基酸序列，以酶原形式经细胞分泌并分解为多种细胞外基质，几乎能降解细胞外基质中的各种蛋白成分、破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，为肿瘤血管内皮细胞迁移、新生血管延伸创造条件[13]。目前MMPs家族已经分离鉴别出26个成员，其中MMP-2及MMP-9是与肿瘤关系最为密切的蛋白酶亚型，可以特异性降解基底膜主要成分Ⅳ型胶原，同时对细胞外基质进行改建，促进肿瘤新生血管的形成[14]。MMP-2位于人类染色体16q21，活化的MMP-2定位于细胞旁穿透基质的突出部位，在酶解细胞外基质Ⅳ型胶原中具有“钻头”作用。MMP-9属于明胶酶，可以作用于Ⅲ型及Ⅳ型胶原，通过在酶链的解除域上插入3个纤维连接蛋白域，分别结合胶原酶、明胶酶及层粘连蛋白。Caspase-8在细胞凋亡过程中占据着中心位置，直接参与细胞的早期凋亡启动、信号传递及晚期凋亡效应[15]。Caspase-8处于凋亡级联反应的顶点，其基因甲基化、突变或者表达异常均会使Caspase-8蛋白表达下调，一些肿瘤细胞得以逃避机体诱发凋亡的监控。上述研究结果显示观察组患者接受膀胱联合灌洗治疗后，血清及冲洗液中的MMP-2、MMP-9蛋白表达水平降低、Caspase-8蛋白表达水平上升，提示在化疗药物灌洗中加入免疫调节剂，可以降低肿瘤侵袭能力，促进肿瘤细胞的凋亡进程。

综上所述，化疗药物联合免疫调节剂进行膀胱灌洗有助于优化机体黏附分子及蛋白酶的表达，降低膀胱恶性肿瘤细胞的侵袭转移能力，促进肿瘤细胞的凋亡。

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Effect of combined perfusion of mitomycin,pirarubicin,immunomodulators on the expression of adhesion molecule,protease in serum and rinses of patients with bladder cancer.

YANG Yu,ZHU Xiao-ying,GUO Jia-xiang.Department of Urology,the First Affiliated Hospital of Chinese PLA General Hospital,Beijing 100048,CHINA

ObjectiveTo analyze the effect of combined perfusion of mitomycin,pirarubicin,immunomodulators on the expression of adhesion molecule,protease in serum and rinses of patients with bladder cancer.MethodsEighty-six patients of non-muscle-invasive bladder cancer received transurethral resection of bladder tumor(TURBT)in our hospital from October 2012 to October 2014 were selected as study objects,including 43 cases of the control group with mitomycin and pirarubicin for perfusion treatment and 43 cases of the observation group with mitomycin,pirarubicin combined with immunomodulators for perfusion treatment.The expression of adhesion molecules,protease in serum and rinses were detected after treatment.Results(1)In serum,CD44v6,E-cadherin, hepaCAM levels in the observation group were significantly higher than those in the control group,while EpCAM,sICAM-1,sVCAM 1 levels in the observation group were significantly lower.(2)In rinses,CD44v6,E-cadherin, hepaCAM levels in the observation group were significantly higher than those in the control group,while EpCAM,sICAM-1,sVCAM-1 levels in the observation group were significantly lower.(3)For protease,MMP-2,MMP-9 levels in serum and rinses of the observation group were significantly lower than those in the control group,while Caspase-8 level of the observation group was significantly higher.ConclusionCombined perfusion of mitomycin,pirarubicin immunomodulators can adjust the expression of adhesion molecules and protease in patients with bladder cancer,inhibit invasion and metastasis ability,and promote apoptosis of tumor cells.

Bladder cancer;Immunomodulators;Adhesion molecules;Protease

R737.14

A

1003—6350（2015）10—1427—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.10.0510

2014-11-19)

吴阶平医学基金(编号：320.6750.13260)

杨 渝。E-mail：yangab316@163.com