复合酶辅助热水浸提法提取榆树皮多糖工艺研究

魏 征，马韵升，刘圣鹏，虞凤慧，王杉杉

（1.黄河三角洲京博化工研究院有限公司，山东 滨州 256500；2.山东京博控股股份有限公司，山东 滨州 256500）

榆树（Ulmus pumilaL.）在我国自然分布较广，且耐寒、耐旱、耐贫瘠。榆树根系发达，抗风保土能力极强，可以在较为干旱的贫瘠荒丘上生长，资源丰富。榆树皮又称榆白皮，主要有利水、通淋、消肿等功能[1]。其皮中富含各种有机物质，如多糖类、胶质、木质素等[2]。现确定植物多糖的主要功能有调节免疫、抑制肿瘤、延缓衰老、降血糖等作用[3]。榆树皮多糖具有很强的还原能力，对羟自由基和超氧自由基在一定程度上有抑制和清除作用[4]，可以作为天然抗氧化剂。

随着人们对多糖食用、药用价值重视程度的提高，目前多糖的实验室提取方法已经比较成熟，主要有水提法、碱液提取法、溶剂提取法、超声波萃取法、微波法、酶法等[5]。近年来，超滤膜技术和超临界萃取技术也逐渐应用于多糖提取领域[6]。传统方法中多糖的提取采用回流法[7-8]，该方法提取率低，极易导致多糖的降解，影响其活性。酶技术的提取条件温和，破坏细胞壁能力强，可以水解植物中的胶质，能充分释放细胞里的活性成分，已被广泛应用于植物中有效成分的提取[9-13]。本试验采用复合酶辅助热水浸提法对榆树皮多糖提取工艺进行研究，在单因素试验的基础上，采用正交设计对榆树皮多糖的提取时间、提取温度、料液比进行优化，旨在获得一种得率高、品质好的榆树皮多糖提取条件，从而为榆树皮多糖的工业生产、开发应用提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

榆树皮：山东博华农业有限公司；纤维素酶（20000U/g）：实验室自制；果胶酶（200 000 U/g）：苏柯汉潍坊生物工程有限公司；葡萄糖（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；无水乙醇（分析纯）、苯酚（分析纯）、硫酸（分析纯）：莱阳经济技术开发区精细化工厂。

1.2 仪器与设备

FA-2004型分析天平：上海上平仪器有限公司；HH-1型数显恒温水浴锅：江苏省金坛市融化仪器制造有限公司；JJ-1型精密增力电动搅拌器：上海浦东物理光学仪器销售部；DL-6M大型低速离心机：长沙湘仪离心机科技有限公司；RE-2000B型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；752N型紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；FD-1A-50型冷冻干燥机：北京博医康有限公司。

1.3 方法

1.3.1 榆树皮多糖提取工艺流程

榆树皮粉末→乙醇脱脂→复合酶浸提→热水浸提→离心→Sevage法除蛋白→浓缩→冷冻干燥→榆树皮多糖粗品

1.3.2 榆树皮多糖提取操作要点

缓冲溶液的配制：分别配制0.1 mol/L的柠檬酸及柠檬酸钠溶液，并按比例配成pH 4.6的缓冲溶液。

复合酶液配制：称取等质量的纤维素酶和果胶酶，加入10倍体积的缓冲溶液，40 ℃水浴活化20 min。

精确称取粉碎的榆树皮粉末10 g，加入15倍体积分数为80%乙醇，于80 ℃水浴脱脂1 h，冷却、离心、收集滤饼备用。将滤饼按料液比1∶10（g∶mL）加入蒸馏水，向榆树皮水溶液中加入0.2%的复合酶（纤维素酶/果胶酶为1∶1），在45 ℃条件下浸提1 h，100 ℃灭酶10 min，冷却，在4 000 r/min条件下离心，收集滤饼，加入蒸馏水，在水浴锅中浸提一定时间后，离心，合并2次上清液，Sevage法除蛋白，减压浓缩至原体积的1/5，冷冻干燥得到榆树皮多糖粗品。

1.3.3 葡萄糖标准曲线的绘制[14-17]

葡萄糖标准溶液的配制：准确称取在105 ℃干燥至质量恒定的葡萄糖标准品0.100 0 g，置于50 mL烧杯中加蒸馏水溶解，并全部转移至100 mL容量瓶中，稀释至刻度，另取10 mL该溶液于100 mL容量瓶中，稀释至刻度，配成质量浓度为0.1 mg/mL葡萄糖标准溶液。

葡萄糖标准曲线的绘制：精密吸取0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL（相当于葡萄糖含量0、0.02 mg、0.04 mg、0.06 mg、0.08 mg、0.10 mg、0.12 mg），分别置于25 mL比色管中，准确补充蒸馏水至2.0 mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸5.0 mL，在旋转均匀器上小心混匀，冷却后，用分光光度计在波长490 nm处测其吸光度值，以试剂空白溶液为参比，制得标准曲线。

1.3.4 样品中多糖含量测定

取干燥榆树皮粗多糖供试品，将其稀释至合适倍数，精确吸取待测液2 mL置于25 mL比色管，按照葡萄糖标准曲线绘制方法，用分光光度计在波长490 nm处测定其吸光度值。从葡萄糖标准曲线回归方程计算葡萄糖的质量，计算样品中多糖含量。多糖含量的计算公式如下：

式中：C为供试液中葡萄糖的质量浓度，μg/mL；D为样品液的稀释因素；F为换算因子；m为样品的质量，g。

1.3.5 多糖得率的计算

榆树皮多糖的得率计算公式如下：

式中：Y为榆树皮多糖得率，%；m1为榆树皮粗多糖质量，g；m0为榆树皮样品质量，g。

1.3.6 单因素试验设计

固定工艺中酶解条件（滤饼按料液比1∶10（g∶mL）加入蒸馏水，向榆树皮水溶液中加入0.2%的复合酶（纤维素酶/果胶酶为1∶1），在45 ℃，pH 4.6条件下浸提1 h，100 ℃灭酶10 min），分别设定提取温度为55℃、65℃、75 ℃、85 ℃、95 ℃，在料液比1∶20、1∶30、1∶50、1∶70、1∶90（g∶mL）条件下分别提取1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h，100 ℃灭酶10 min，冷却，过滤，Sevage法除蛋白后，浓缩至原体积的1/5，冷冻干燥，制得粗多糖。计算榆树皮多糖得率，分别考察提取温度、时间、料液比对榆树皮多糖得率的影响。

1.3.7 正交试验设计

根据单因素试验结果，选取提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）为3个对榆树皮多糖得率有影响的因素，进行正交试验，以榆树皮多糖得率为评价指标，最终确定榆树皮多糖提取的最优工艺条件。正交试验设计因素与水平见表1。

表1 榆树皮多糖提取条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for elm bark polysaccharide extraction conditions optimization

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的建立

采用硫酸-苯酚法测定不同质量的葡萄糖在波长490 nm处的吸光度值，以葡萄糖含量（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制出葡萄糖标准曲线，结果如图1所示。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

由图1可知，在葡萄糖含量0～0.12 mg范围内，标准曲线线性回归方程为y=8.002 1x-0.015 5，拟合系数R2=0.998 1，表明葡萄糖含量与吸光度值呈良好的线性关系。

2.2 各单因素对榆树皮多糖提取效果的影响

2.2.1 提取温度对榆树皮多糖提取效果的影响

不同提取温度条件下的榆树皮多糖得率如图2所示。

图2 温度对榆树皮多糖得率的影响Fig.2 Effect of temperature on elm bark polysaccharide yield

由图1可知，不同的提取温度对多糖得率有明显的影响。结果表明，浸提温度在55～75 ℃的范围内，多糖得率随着提取温度的升高而增加；提取温度＞75 ℃，继续提高提取温度，得率反而降低，可能是随着提取温度的升高，糖苷键容易断裂，多糖分解，从而影响多糖得率。因此，选择提取温度为75 ℃最佳。

2.2.2 提取时间对榆树皮多糖提取效果的影响

不同提取时间条件下的榆树皮多糖得率如图3所示。

图3 提取时间对榆树皮多糖得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on elm bark polysaccharide yield

由图3可知，多糖得率随着提取时间的延长而增加，原因是时间的延长有利于多糖的溶出，增加了多糖在溶剂中的溶解度。当提取时间达到2.5 h时，多糖得率达到12.6%，此后继续增加提取时间，多糖得率得变化趋势较平缓，表明多糖浸出已基本完成。因此，选择2.5 h作为提取时间较适宜。

2.2.3 料液比对榆树皮多糖提取效果的影响

不同料液比条件下的榆树皮多糖得率如图4所示。

由图4可知，料液比在1∶20～1∶70（g∶mL）的范围内，多糖得率随着料液比的增加而增加；料液比＞1∶70（g∶mL）后，继续增大料液比多糖得率反而降低，可能是因为料液比的增加有利于杂质等非糖成分的溶出，考虑到料液比过大也会增加后期浓缩分离的能源消耗，因此选择料液比1∶70（g∶mL）最佳。

图4 料液比对榆树皮多糖得率的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on elm bark polysaccharide yield

2.3 提取榆树皮多糖的工艺优化正交试验

在单因素试验的基础上，对提取时间、提取温度、料液比进行正交试验，试验设计及分析结果见表2，方差分析见表3。

表2 榆树皮多糖提取条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment for elm bark polysaccharide extraction conditions optimization

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，根据极差R的大小，可以判断各因素对试验指标的影响主次。可见影响榆树皮多糖得率的因素主次顺序为B＞A＞C，即提取时间＞提取温度＞料液比。榆树皮多糖提取的最优方案为A1B3C2，即提取温度70 ℃，提取时间3.0 h，料液比1∶70（g∶mL）。在此最优提取条件下进行验证试验，榆树皮多糖得率达到13.143%，高于正交试验表中最大得率12.869%，故可以认为该组合为复合酶辅助热水浸提法提取榆树皮多糖的最佳提取工艺。

由表3方差分析可知，提取时间、提取温度、料液比对榆树皮多糖的得率均无显著影响。

2.4 对比试验

为了考察复合酶辅助热水浸提法提取榆树皮多糖的得率，在提取时间、提取温度、料液比相同的条件下，与传统的热水浸提法进行了对比试验，结果如表4所示。

表4 两种榆树皮多糖提取方法的比较Table 4 Comparison of two extraction methods of elm bark polysaccharide

由表4可知，与传统热水浸提法相比，复合酶辅助热水浸提法提取榆树皮多糖得率提高超过3个百分点，说明复合酶辅助热水浸提法能有效促进榆树皮多糖的提取。

3 结论

本研究采用复合酶辅助热水浸提法提取榆树皮多糖。通过单因素及正交试验，以榆树皮多糖得率为评价指标进行优化，得到最优提取条件为提取温度70 ℃，提取时间3.0 h，料液比1∶70（g∶mL），复合酶添加量0.2%。并在此最优提取条件下进行验证试验，榆树皮多糖得率达到13.143%，比传统的热水浸提法提高超过3个百分点。

热水浸提法工艺比较简单，易于操作，但是提取效率低，酶法则利用纤维素酶、果胶酶去分解植物细胞壁及细胞膜的成分，对组织细胞造成破坏，从而促进胞内有效成分的溶出，利用复合酶辅助热水浸提法提取榆树皮多糖，具有提取率高等优点，可为大规模工业化生产榆树皮多糖提供理论依据。

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