响应曲面法优化柠檬干片护色剂配方的研究

李 鹤，林洪斌，安 都，林琼芳

（1.西华大学 食品与生物工程学院，四川 成都 610039；2.成都永胜福名果蔬农民专业合作社，四川 成都 610103）

柠檬（Citrus limon）为芸香科柑桔属、枸橼柠檬类植物，原产于喜马拉雅东部，包括印度和我国西藏东南部[1]，目前四川安岳是我国柠檬主产区。柠檬富含维生素、苹果酸、奎宁酸、钙、磷、铁及烟酸等，不仅具有丰富的营养还具有重要的药用价值，具有防治结石、预防心血管疾病，生津止渴、祛暑安胎、健胃等功效[2]。柠檬干片因其方便贮藏、具有较长的保质期，受到消费者的青睐。目前市售柠檬干片主要为烘干或者晒干制品，不仅出现干缩、褐变现象，而且生理活性成分损失较大[3]。如何在柠檬干片的制作过程中，尽可能的控制其褐变成为亟待解决的问题。经报道，常用的鲜切蔬菜水果护色剂超过10种，其中包括酸性试剂、还原剂、螯合物、离子化合物等。植酸、柠檬酸、草酸属于常见的酸性护色剂，能够降低降低体系的pH值；常见的离子化护色剂有氯化钠、氯化钙，高浓度的盐对酶蛋白有一定的抑制作用[4]；维生素C（Vitamin C，VC）是一种常见的还原剂；L-半胱氨酸是一种无毒、无副作用的天然抗酶促褐变剂[5-6]。但针对柠檬干片制作过程中经济、有效的护色剂还鲜有报道，本研究对柠檬干片护色剂进行筛选、组合，旨在找到能有效抑制柠檬干片褐变的护色剂配方。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

安岳尤力克柠檬：四川省奇奇食品有限责任公司。

植酸、柠檬酸、草酸、维生素C、L-半胱氨酸、氯化钙、氯化钠等（食品级）：上海华津生物科技有限公司；偏磷酸、氢氧化钠、抗坏血酸等（分析纯）：成都科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

YLD-2000型电热恒温古风干燥箱：黄石市恒丰医疗器械有限公司；UV-2600A紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；TB-214型电子天平：美国丹佛仪器设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 柠檬干片加工工艺流程

柠檬原料果→选择→清洗→切片→护色液浸泡→沥干→热风干燥→包装→成品

1.3.2 操作要点

原料的选择：选用结构紧密、表面光滑、水分饱满的新鲜柠檬作为柠檬干片的制作原料[7]。

切片：柠檬为椭圆形，按照横径进行切片，并将柠檬切片厚度控制在3 mm。

护色液浸泡、沥干：将切片的柠檬片分别放置于质量分数不同的护色溶液中进行浸泡，浸泡时间为30 min，浸泡后沥干3 min[8]。

热风干燥：将经过浸泡的柠檬片取出后在热风干燥箱中进行干燥，干燥温度为80 ℃，干燥时间为4 h[9]。

1.3.3 护色剂选择单因素试验

按照表1进行单因素试验，选择7种常用护色剂，每种护色剂分别选择4个质量分数梯度对柠檬干片进行试验，以不加护色剂为空白为对照，确定最适合柠檬干片的几种护色剂。

表1 柠檬干片护色剂的选择因素与水平Table 1 Factors and levels of single factor test for the colorpreserving reagents of lemon slice optimization

1.3.4 柠檬干片护色剂配比优化

在单因素试验的基础上，选择柠檬酸、L-半胱氨酸、氯化钙溶液质量分数为评价因素，以柠檬干片的褐变抑制率为响应值，采用Box-Behnken3因素3水平的响应曲面试验分析方法以确定复合护色剂中的氯化钙、L-半胱氨酸、柠檬酸的用量。其响应曲面设计的因素与水平见表2。

表2 柠檬干片护色剂配方优化响应面试验因素与水平Table 2 Factor and levels of response surface experiments for color-preserving reagents of lemon slices optimization

1.3.5 柠檬干片护色效果的评价

（1）褐变抑制率的测定[10]

取1.0 g柠檬干片（果肉部分）于打浆机中，加入冰冷蒸馏水100 mL，匀浆1 min后过滤，将滤液置于25 ℃水浴锅中水浴30 min，在波长420 nm处测其吸光度值A。每次测定进行3次平行试验，试验结果以平均值计算。

式中：A0为未经护色剂处理的柠檬干片水解液的吸光度值，A为经护色剂处理的柠檬干片水解液的吸光度值。

（2）脱水率的测定

浸泡前分别称量放入不同溶液中新鲜柠檬片总质量；干燥后分别称量不同溶液处理后干制柠檬片质量。

（3）复水比的测定

分别称一定量不同溶液处理后的干制柠檬片，置于热水中浸泡30 min后取出，再次分别称量。

（4）维生素C含量测定

以紫外分光光度法快速测定柠檬干片中的维生素C含量[11]。

2 结果与分析

2.1 柠檬干护色剂单因素试验结果

7种常见护色剂中，对柠檬干片最有效的护色剂是柠檬酸、L-半胱氨酸以及氯化钙，其质量分数最优水平分别为2.0%、0.3%、1.5%。

2.2 柠檬干片护色剂配比优化结果

表3 柠檬干片护色剂配比优化响应面试验结果Table 3 Results of response surface experiments for compound color-preserving reagents of lemon slices optimization

在单因素试验结果的基础上，选择柠檬酸、L-半胱氨酸、氯化钙溶液质量分数为评价因素，以褐变抑制率（Y）为响应值，利用Box-Behnken的中心组合试验设计3因素3水平的响应曲面试验方法共进行15组试验，结果如表3所示。

2.1.1 模型方程的建立及显著性检验

运用Minitab16软件对柠檬干片的褐变抑制率进行结果分析，得到褐变抑制率（Y）对柠檬酸（A）、L-半胱氨酸（B）、氯化钙（C）的二次多项回归方程为：

Y=60.736 7+5.408 75A+5.738 75B+5.607 50C-1.630 00AB+0.925 00AC-2.722 50BC-5.365 83A2-5.120 83B2-3.653 33C2

对所得模型和回归方程系数进行显著性检查，其结果见表4和表5。

表4 回归模型及各项的方差分析Table 4 Variance analysis of fitted model

在回归方程中，A、B、C变量的正系数表明该变量的正向变化能引起响应值的增加；负的二次项系数表明方程的抛物线开口向下，具有极大值点，能够进行最优分析。T检验表明：方程式中A、B、C、A2、B2、C2、AB、BC均在P＜0.05水平显著，说明复合护色剂对柠檬干片褐变的影响不是简单的线性关系。从回归模型的方差分析结果可知，实验所选用模型P＜0.01，极显著；失拟项P＞0.05，不显著；经F检验，可知该模型的线性及平方均极显著，交互作用显著；决定系数R2=0.992 2，调整决定系数R2Adj为0.978 0，说明该模型能够用来预测护色剂对柠檬干片的褐变程度的影响。

表5 回归系数显著性检验Table 5 Variance analysis of coefficient of regression

2.2.2 响应曲面分析与条件优化

响应曲面图和等高线图可以直观反映响应值随因素的变化趋势[14]，根据褐变抑制率（Y）对柠檬酸（A）、L-半胱氨酸（B）、氯化钙（C）的二次多项回归方程分别绘制响应曲面图和等高线图，以确定复合护色剂对柠檬干片褐变的影响。响应曲面图和等高线见图1。

图1 柠檬酸、L-半胱氨酸和氯化钙的交互作用对柠檬干片褐变抑制率的响应曲面及等高线Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between citric acid,L-Cys and CaCl2on browning inhibition rate

等高线的形状可以反映出因素间的交互作用的强弱大小，等高线呈椭圆形表示两因素交互作用显著，而等高线呈圆形则表示两因素交互作用不显著[15]。由图1可知，柠檬酸与L-半胱氨酸、L-半胱氨酸与氯化钙交互作用显著，柠檬酸与氯化钙交互作用不显著。

对二次回归方程求解，得到各因素的最佳水平值，分别为A=0.535，B=0.272，C=0.737，即柠檬干片褐变抑制率最佳的护色剂组合为柠檬酸2.27%、L-半胱氨酸0.33%、氯化钙1.87%，在此条件下柠檬干片的理论褐变抑制率为65.01%。

2.3 验证试验

为验证最佳条件的可行性，采用响应曲面优化结果进行柠檬干片褐变抑制率的验证试验，并对柠檬干片的脱水率、复水比、VC含量进行测定并与未添加护色剂的柠檬干片进行对比。考虑到实际操作情况，调整柠檬酸为2.3%、L-半胱氨酸0.3%、氯化钙1.9%进行验证试验，其结果如表6所示。

表6 验证试验结果Table 6 Results of verification experiments

由表6可知，验证试验结果与理论值相差较小，因此采用响应曲面法优化复合护色剂条件，对抑制柠檬干片的褐变具有实际应用价值；添加护色剂的柠檬干片在脱水率、复水比与未添加护色剂的柠檬干片差异不大，而添加护色剂的柠檬干片VC含量要高于未添加护色剂的，这可能是护色剂抑制柠檬干片的褐变，从而降低了褐变对VC含量的影响。

3 结论

根据单因素试验分析，得到柠檬酸、L-半胱氨酸和氯化钙能有效抑制柠檬干片的褐变。在单因素试验的基础上，应用响应曲面设计优化柠檬干片的复合护色剂，得到最佳复合护色剂为柠檬酸2.27%、L-半胱氨酸0.33%、氯化钙1.87%，在此条件下柠檬干片的理论褐变抑制率为65.01%。考虑到实际情况，调整柠檬酸为2.3%、L-半胱氨酸0.3%、氯化钙1.9%，得到柠檬干片的褐变抑制率为64.87%，该回归方程能有效预测柠檬干片的褐变抑制率。并在此条件下将其与未添加护色剂的柠檬干片进行对比，其脱水率、复水比均无较大差异，而VC含量高于未添加护色剂的柠檬干片。

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