长白山野生白耙齿菌菌株ITS序列鉴定及其人工驯化栽培试验

于 萍，隋飞飞，陈艳秋

（延边大学农学院，吉林 延吉 133002）

长白山野生白耙齿菌菌株ITS序列鉴定及其人工驯化栽培试验

于 萍，隋飞飞，陈艳秋*

（延边大学农学院，吉林 延吉 133002）

试验以长白山野生白耙齿菌菌株为试验材料，进行ITS序列鉴定及人工驯化栽培试验。利用通用引物ITS1和ITS4进行ITS序列鉴定，同时利用农作物下脚料对白耙齿菌进行人工驯化栽培。原种培养料设置6个处理，栽培种培养料设置8个处理，通过ITS序列分析结果得出该菌株ITS序列与NCBI中登录号为JX290578．1、FJ462768．1、EU301643．1等9个白耙齿菌菌株相似性达100%，验证了其为白耙齿菌（Irpex lacteus）；最佳原种培养料配方为木屑41．5%、豆秸41．5%、麦麸10%、黄豆粉5%、石膏1%、白糖1%，菌丝生长速度最快，为7．571 mm·d-1，且菌丝浓密，洁白，粗壮；最佳栽培种培养料配方为木屑54%、玉米芯29%、麦麸10%、黄豆粉5%、石膏1%、白糖1%，菌丝生长速度及长势显著高于其他处理。

白耙齿菌；ITS序列分析；人工驯化

白耙齿菌（Irpex lacteus） 又名白囊孔菌、白囊耙齿菌。分类学上隶属于担子菌亚门 （Basidiomycetes）层菌纲（Hymenomycetes）非褶菌目（A－phyllophorales） 多孔菌科（Polyporaceae） 耙齿菌属（Irpex Fr．）[1]。在我国主要分布于吉林省、河北、山西、江西、甘肃、云南、福建、西藏等省区[2]。

由于白耙齿菌中含有多种药用成分[3-4]，已被广泛应用于药物制剂，经深层发酵物中提取的“乳白耙齿菌多糖”[2，5]，已经制成胶囊制剂，用于治疗慢性肾小球肾炎，临床效果良好，是一种极具市场开发潜力的药用菌。但白耙齿菌对生长发育的环境条件要求较苛刻，随着市场开发速度加快，野生资源不断减少，已呈现供不应求的现象。针对这一现象，本试验对采自长白山林区的野生白耙齿菌菌株进行ITS序列分析，验证形态学鉴定结果，通过人工驯化栽培体系的研究，筛选出适宜长白山林区野生白耙齿菌菌丝生长的原种及栽培种配方，为开发、利用这一野生资源提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株子实体于2010年采自长白山林区，吉林农业大学图力古尔教授通过形态学鉴定为白耙齿菌（Irpex lacteus）。将子实体在无菌条件下进行组织分离，经PDA培养基纯化后获得供试菌株。菌种由延边大学农学院应用真菌实验室保存。

1.2 试验方法

1．2．1 ITS序列分析

采用改良十六烷基三甲基溴化铵法（Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide,CTAB）法[6]提取白耙齿菌DNA，将提取的DNA用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，然后放入-20℃冰箱中保存备用。

利用ITS序列通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGT GAACCTGCGG-3’） 和 ITS4（5’-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3’）对样本进行扩增，其扩增体系为：2．5 μL 10×PCR Buffer，2 μL dNTP Mixture，1 μL引物，2 μL模版，0．25 μL Taq DNA聚合酶，ddH2O补置25 μL；反应程序为：94℃预变性5 min，94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，72℃最后延伸10 min，35个循环，4℃保存。将扩增产物进行序列测定，其测序结果同GenBank中其他白耙齿菌菌株ITS序列进行比较，分析其亲缘关系，验证形态学鉴定结果。

1．2．2 原种培养料配方筛选

原种培养料分别选用杂木屑、玉米芯、豆秸为主料，麦麸、黄豆粉、石膏、白糖为辅料，培养料组成和编号见表1。按上述原种培养料配方及常规方法拌好新鲜、无霉变、无虫害的主料和辅料，装入500 mL的原种瓶中，用聚丙烯膜封口后在121℃下灭菌90 min。每个处理重复5次。接种后置于25℃恒温箱中进行暗培养。待菌丝萌发后，定时记录菌丝体生长速度，观察菌丝体长势、颜色、密度及满瓶时间。采用Excel 2003和SPSS11．7进行数据整理和差异显著性分析。

表1 白耙齿菌原种培养料配方Tab．1 Original media formula of Irpex lacteus

1．2．3 栽培种培养料配方筛选

栽培种培养料分别选用杂木屑、玉米芯、豆秸为主料，麦麸、黄豆粉、石膏、白糖为辅料，培养料组成和编号见表2。按上述栽培种培养料配方及常规方法拌好新鲜、无霉变、无虫害的主料和辅料，装入规格为17 cm×33 cm栽培袋中，装料重为450 g，高约8 cm～9 cm，每个配方重复5次，在121℃下灭菌90 min，其他试验方法、步骤、测定项目同1．2．2。

表2 白耙齿菌栽培种培养料配方Tab．2 Plant media formula of Irpex lacteus

2 结果与分析

2.1 ITS序列分析鉴定结果

通过改良CTAB法提取的DNA质量较好，符合下一步试验要求。利用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增成功得到ITS序列片段，见图1。将ITS序列结果在NCBI中进行BLAST比对，

图1 白耙齿菌ITS区域碱基序列Fig．1 Nucleotide sequence of ITS region of DNA from Irpex lacteus

发现目标序列与登录号为JX290578．1、FJ462768．1、

EU301643．1等9个白耙齿菌菌株相似性达100%，进一步验证了其形态学鉴定结果。

2.2 不同原种培养料配方对白耙齿菌菌丝生长影响不同原种培养料配方对白耙齿菌菌丝生长的影响见表3、图2。

表3 不同原种培养料配方对白耙齿菌菌丝生长的影响Tab．3 Effects of different stock medium on mycelia growth of Irpex lacteus

如表3所示，在配方5中生长的菌丝生长速度最快，为7．571 mm·d-1，满瓶时间最短。

图2 不同原种培养料配方中白耙齿菌菌丝生长情况Fig．2 Mycelia growth condition of Irpex lacteus in different stock medium

由图2中可以看出，配方5菌丝浓密，洁白，粗壮。配方6中无论是菌丝生长速度、浓密度及长势较其他配方差，说明白耙齿菌菌丝对玉米芯利用率不高。综上所述，配方5（木屑41．5%、豆秸41．5%、麦麸10%、黄豆粉5%、石膏1%、白糖1%）为白耙齿菌菌丝生长最适原种培养料，其菌丝对木屑和豆秸有较好的利用率。

2.3 不同栽培种培养料配方对白耙齿菌菌丝生长的影响

不同栽培种培养料配方对白耙齿菌菌丝生长的影响不同，见表4、图3。

表4 不同栽培种培养料配方对白耙齿菌菌丝生长的影响Tab．4 Effects of different culture medium on mycelia growth of Irpex lacteus

图3 不同栽培种培养料配方中白耙齿菌菌丝生长情况Fig．3 Mycelia growth condition of Irpex lacteus in different culture medium

从表4和图3中可以看出，配方8中菌丝生长速度显著优于其他配方，为5.044 mm·d-1，图3中可以观察到配方8菌丝体浓密，粗壮，没有污染情况。配方6仅次于配方8。配方4中菌丝生长一段时间后出现生长停滞现象，未满袋。待所有菌袋长满后，配方1、配方2、配方5、配方8菌袋中均有原基出现。综上所述，白耙齿菌菌丝生长的最佳栽培种培养料配方为配方8（木屑54%、玉米芯29%、麦麸10%、黄豆粉5%、石膏1%、白糖1%）。

3 结论

将ITS序列结果在NCBI中进行BLAST比对，发现目标序列与登录号为JX290578.1、FJ462768.1、EU301643.1等9个白耙齿菌菌株相似性达100%，进一步验证其形态学鉴定结果。在试验范围内，原种培养料配方5（木屑41.5%、豆秸41.5%、麦麸10%、黄豆粉5%、石膏1%、白糖1%）中菌丝生长速度快，菌丝浓密，粗壮，满瓶时间为20 d，为最佳原种培养料配方。以配方8（木屑54%、玉米芯29%、麦麸10%、黄豆粉5%、石膏1%、白糖1%）为栽培料时，菌丝生长速度显著高于其他配方，长势较好，为最佳栽培种培养料配方。在出菇试验过程中，部分栽培料中已经形成原基，而有关原基生长、分化所需要的最佳培养条件需要进一步研究。

[1]Yan ZK,Li WL.Colour pictures of medicinal plants of Changbai mountain of China[M].Peking:People’s Medical Publishing House,1992:324.

[2]戴玉成，图力古尔.中国东北野生食药用真菌图志[M].北京：科学出版社，2007：100.

[3]杨真威，姜瑞芝，陈英红，等.耙齿菌糖蛋白I 1-2-1的化学研究[J].中草药，2005（36）：1130-1132.

[4]杨真威，姜瑞芝，陈英红，等.耙齿菌糖蛋白的提取和分离、理化性质及抗炎活性[J].天然产物研究与开发，2005，3（17）：280-282.

[5]袁文彬，王淑敏，翁丽丽，等.白耙齿菌发酵物多糖及蛋白含量测定[J].长春中医药大学学报，2012，28（3）：537 -538.

[6]吴发红，黄东益，黄小龙，等.几种真菌DNA提取方法的比较[J].中国农学通报，2009（8）：62-64.

ITS Sequence Identification and Artificial Domesticated Cultivation Test of Irpex lacteus from Changbai Mountain

YU Ping,SUI Fei-fei,CHEN Yan-qiu
(College of Agronomy,Yanbian University,Yanji 133002,China)

Taking Irpex lacteus strain of Changbai Mountain as the tested material,its molecular identification and artificial domesticated cultivation were studied．The ITS1 and ITS4 of universal primers were used to identify the sequence of ITS,at the same time,the agricultural residues were used in the I.lacteus domestication．We set 6 disposes for original media formula and 8 disposes for plant media formula,then each dispose have 5 times．The identities of ITS sequence indicate the tested material is I.lacteus.It is similarity with nine I.lacteus of sequence,suce as JX290578．1,FJ462768．1,EU301643．1．The original media formula for I.lacteus cultivation is considered to be that within composed of sawdust 41．5%,beanstalk 41．5%,wheat bran 10%, soybean meal 5%,gypsum 1%,sugar 1%,and the mycelia had the fast growth speed with 7．571 mm·d-1．The mycelia is very thick,white and strong．The most suitable medium is composed of sawdust 54%,corncob 29%,wheat bran 10%,soybean flour 5%,gypsum 1%,sugar 1%．Its mycelia growth rate was significantly higher than other disposes．

Irpex lacteus;ITS sequence analysis;artificial domestication cultivation

S646.9

A

1003-8310（2015）06-0038-04

10．13629/j．cnki．53-1054．2015．06．010

于萍 (1990-)，女，在读硕士研究生，研究方向为特种植物资源利用与生物技术。E-mail:912568268@qq．com

*通信作者：陈艳秋（1963-），女，博士，教授，主要从事食 (药)用真菌资源、栽培生理及分子生物学应用研究。E-mail:cyq326@126．com

2015-09-28