组织金属蛋白酶抑制剂-1低表达系膜细胞模型的建立

陈曦曌，吕 杨，谢院生，陈香美

解放军总医院 肾病科、肾脏疾病国家重点实验室、国家慢性肾病临床医学研究中心，北京 100853

组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitorsof metalloproteinases，TIMPs)是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的主要细胞抑制剂。作为一种分泌性蛋白[1]，其功能主要有增强红细胞活性[2]，促进细胞增殖或凋亡等[3-4]，并参与许多细胞因子的调控[5]。对大多数肾脏疾病而言，细胞外基质的积聚起到了极其重要的作用[6]，TIMPs可以通过拮抗MMP的活性、抑制细胞外基质的降解，介导局部炎症反应和免疫反应等途径，参与肾疾病的发生、发展过程[7-8]。小RNA干扰[9-10]是生物体内存在的一种通过双链RNA来抵御病毒入侵和抑制转座子活动的自然机制。序列特异的双链小RNA分子在mRNA水平上关闭相应序列基因的表达，又称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。因此，我们利用这种特异、高效、简便的转录后基因沉默技术构建TIMP-1低表达大鼠系膜细胞模型，并用于研究TIMP-1在系膜细胞中的功能，以明确其在系膜增殖性肾炎发生、发展中的作用，这一发现对补充和完善该病的发病机制和主要病理生理过程意义重大。另外，低表达模型的建立，对于对照验证某些靶向药物的治疗效果也具有一定的作用。

材料和方法

1 材料 LipofectamineTMRNAiMAX试剂，Invitrogen公司；FAM标记的无义siRNA及3条TIMP1 siRNA(siTIMP1-1，siTIMP1-2，siTIMP1-3)序列由吉玛基因公司合成；第9代原代大鼠系膜细胞由解放军总医院肾脏病国家重点实验室提供；1640培养基、胎牛血清、Opti-MEM，Gibco公司；Trizol试剂，Ambion公司；RT-PCR试剂盒，TransGen Biotech公司；Taqman探针由美国ABI公司设计合成并提供；7500型荧光定量PCR仪，Waters公司。

2 siRNA转染第9代大鼠系膜细胞 第9代大鼠系膜细胞在37℃ 5% CO2饱和湿度下用15% FCS 1640培养于六孔板内，转染前融合度为60% ~ 70%。每孔细胞加入250μl Opti-MEM和8μl siRNA (对照组为8μl FAM标记的无义siRNA)，弹匀，静置15 ~ 20 min后加入8μl RNAimax再弹匀，静置15 ~ 20 min，培养12 h后换液，48 h后收集细胞。

3 转染后大鼠系膜细胞总RNA提取 用Trizol裂解细胞，每25 cm2大小的细胞培养瓶加入Trizol 1 ml，氯仿与Trizol比例为1∶5，加入氯仿200μl，充分混匀后于冰上静置15 min，4℃，12 000 g，离心15 min。取上清后加入等量异丙醇，充分混匀，4℃，12 000 g，离心15 min。去上清，加入1 ml 75%乙醇，混匀，4℃，12 000 g，离心1 min，重复此步骤1次。小心去除上清，管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3 ~ 5 min。每个EP管加入20μl DEPC水，冰上静置30 min后用紫外分光光度计测定RNA在260 nm与280 nm处光密度值(OD值)，并计算出浓度。

图1 荧光显微镜观察转染无义siRNA后48 h小鼠系膜细胞(×100)A： 普通光镜下视野； B： 荧光显微镜下视野； C： 光镜合并荧光显微镜Fig. 1 Fluorescent microscope image of MCs at 48 hours after nonsense siRNA transfecting (×100)A: Light microscope image; B: Fluorescent microscope image; C: Merged image of A and B

4 Taqman探针法检测TIMP-1的mRNA表达水平 将提取的细胞总RNA逆转录为cDNA，逆转录体系20μl，包含2×TS Reaction Mix 10μl，TransScript RT/RI Enzyme Mix 1μl，Anchored Oligo(dT)18 Primer (0.5 ug/μl)1μl。采用7500型荧光定量PCR仪进行PCR扩增，反应体系20 μl，每孔含cDNA 4μl、Taqman探针1μl、RNase-free水5μl、Taqman®Gene Expression Master Mix 10μl，反应条件为变性95℃15 s，退火延伸60℃1 min，共40个循环。每个标本同时扩增TIMP-1和18 s，采用2-△△CT作为TIMP-1 mRNA的相对表达量。

结 果

1 无义siRNA转染小鼠系膜细胞后的荧光观察荧光显微镜观察可见，转染siRNA的小鼠系膜细胞90%可发出绿色荧光。见图1。

2 利用Taqman探针法检测对照组和siRNA组系膜细胞中TIMP-1的mRNA水平siTIMP1-1组、siTIMP1-2组和siTIMP1-3组细胞内TIMP-1的mRNA表达水平与对照组相比均降低，差异有统计学意义。见图2。

图2 各组TIMP-1 mRNA相对表达量Fig. 2 Relative expression level of TIMP-1 mRNA (aP＜0.01, vs control)

讨 论

RNA干扰是一种进化上保守的抑制靶基因表达的机制[11]。它通过介导序列特异性的mRNA降解发挥其沉默效应，其主要机制是转录后抑制，可分为启动和效应两个阶段，RNA干扰的应用已成为抑制特定基因表达的重要工具[12-14]。目前获得siRNA的方法主要有体外转录法、化学合成法、载体表达法等[15]。本研究以TIMP-1为靶基因力求构建其siRNA以抑制TIMP-1的表达，从而建立TIMP-1低表达的大鼠系膜细胞模型，后者可用于一系列关于TIMP-1功能的研究，以明确其在系膜增殖性肾炎发生、发展的作用，甚至包括靶向治疗药物的开发等。

研究表明，同一个mRNA中，针对不同位点的siRNA的沉默效率截然不同，一个或几个核苷酸的位移就可明显影响其沉默效率[16]。这有可能是因为这些靶mRNA常形成复杂的分子内结构，影响siRNA反义链与之碱基配对结合，进而影响RNAi效率。除此之外，还有许多因素会影响siRNA的活性，如靶mRNA的结构、siRNA的热力学稳定性和siRNA的碱基特征等[17]。因此，我们需要精心设计siRNA序列以达到有效的沉默效果。在本研究中，我们设计了3种不同的siRNA序列，并从中筛选出最佳的序列用于今后的实验研究。

TIMP-1作为基质金属蛋白酶的主要抑制物之一，与许多肾疾病的关系密切。曾有研究[18]报道，MMP-9/TIMP-1失衡参与了IgA肾病的肾小球硬化过程。与此同时，TIMP-1通过对MMPs的抑制，下调了细胞外基质的降解过程，并导致细胞外基质积聚，这一点在肾纤维化中起关键作用[19]。因此，我们通过小RNA干扰的方式使得大鼠系膜细胞内TIMP-1的表达量降低，以期在后续实验中可进一步达到体外治疗的效果。在此基础上，我们设计了3种不同的siRNA序列，并对它们的沉默效应进行比较。结果表明，这3种siRNA序列均有效抑制TIMP-1在大鼠系膜细胞中的表达，并且第一条siRNA序列siTIMP1-1效果最佳。在未来的研究工作中，我们可以利用该siRNA进行动物体内治疗试验，这一工作将为抑制肾炎症反应、减少肾ECM聚集、释放MMPs降解功能、阻止甚至逆转肾纤维化进程、改善肾结构及功能打下基础。也为进一步研究siRNA的作用，探索TIMP-1对炎症作用和肾纤维化的影响，寻求预防和治疗肾疾病的有效措施奠定了实验基础。

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