参松养心胶囊对大鼠心室肌细胞L-型钙电流和钾电流的抑制作用

程林忠，程瑜蓉，李 青△

(1.山西医科大学第一临床医院，太原 030001;2.首都医科大学附属北京朝阳医院，北京 100020)

参松养心胶囊对大鼠心室肌细胞L-型钙电流和钾电流的抑制作用

程林忠1，程瑜蓉2，李 青1△

(1.山西医科大学第一临床医院，太原 030001;2.首都医科大学附属北京朝阳医院，北京 100020)

目的:探讨参松养心胶囊对大鼠心室肌细胞L-型钙电流(Ica，L)和瞬时外向钾电流(Ito)的抑制作用。方法:酶解法分离大鼠心室肌细胞，使用参松养心溶液(0.5 mg/100 mL，0.5%)灌流心室肌细胞，利用全细胞膜片钳技术记录Ica，L和Ito，在细胞破膜后的20 min内记录所有数据，对每个细胞给药前后做自身对照，观察参松养心溶液对Ica，L和Ito通道电流的影响。结果:0.5%的参松养心溶液对Ica，L和Ito均有抑制作用，参松养心溶液对Ito的缓慢电流成分Itos无明显作用，但可以明显抑制Ito的快速电流成分Itof。在-10 mV测试电压下，在0.5%的参松养心溶液作用后，Ica，L的最大激活峰值电流密度从(-8.64+-2.43)pA/pF降为(-5.92+-2.15)pA/pF，抑制率为31.85%+10.25%，电流密度-电压(I-V)曲线上移;在-60 mV测试电压下，在0.5%的参松养心溶液作用后，Itof的最大激活峰值电流密度从(23.53+3.31)pA/pF降为(16.86+2.34)pA/pF，抑制率为(28.33+10.59)%，I-V曲线下移。参松养心溶液不改变Ica，L的通道动力学，但会使Ito通道失活后的恢复变慢。结论:参松养心溶液对Ica，L和Ito均有明显的抑制作用。

参松养心胶囊;L-型钙电流;瞬时外向钾电流;抑制

参松养心胶囊是由甘松、麦冬、人参等12种中药组成的通络复方制剂。参松养心胶囊不仅可以实现心脏自主神经的调节，而且可以改善心脏传导系统和心肌细胞的代谢，抑制心肌细胞的自律性，具有良好的抗心律失常作用［1］。有研究报道，参松养心胶囊可明显减少缺血再灌注所致心率失常的发生，并对药物诱发的心率失常具有显著的抑制作用［2］。同时有研究证明，采取多中心随机对照临床试验，患者的室性早搏症状在服用参松胶囊后会有所减轻，且患者出现的心脏副作用并不明显［3］。但目前并没有对参松养心胶囊抗心律失常机制的报道。本研究利用全细胞膜片钳记录方法，探究参松养心胶囊对不同心肌离子通道的影响，结果提示参松养心胶囊溶液对心肌多种离子通道均有不同程度的抑制作用，可以实现抗心律失常作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与溶液

参松养心胶囊由河北石家庄以岭药业有限公司提供。胰蛋白酶E购自Merck公司，II型胶原酶购自Gibico公司。乙二醇-双四乙酸(EGTA)、N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)、L-谷氨酸、葡萄糖、氯化胆碱、K2ATP、牛磺酸、MgATP、氯化铯、Na2ATP、CaCl2由Sigma公司提供。4-氨基吡啶(4-AP)、氯化四乙胺(TEA-Cl)由Fluka公司提供，其他常规试剂由北京化学试剂公司提供，均为分析纯。

溶液:①0.5%参松养心胶囊溶液:参松养心干粉用无KCl的细胞外灌流液溶解，所配制溶液的质量百分比浓度为0.5%，然后把K+浓度调整为5.4 mmol/L，离心后去上层溶液备用;②KB液(mmol/ L):80 KOH、40 KCl、3.0 MgSO4、50 L-谷氨酸、20牛磺酸、10 HEPES、10葡萄糖、0.5 EGTA，NaOH调至pH=7.4;③无钙台氏液(mmol/L):5.4 KCl、136 NaCl、1.0 MgCl2、0.33 NaH2PO4、10 HEPES、10葡萄糖，NaOH调至 pH=7.4;④Ica，L电极内液(mmol/ L):1.0 MgCl2、5.0 MgATP、120 CsCl、10 EGTA、10 HEPES，CsOH调至pH=7.3;⑤Ito电极内液(mmol/ L):1.0 MgCl2、20 KCl、5.0 HEPES、4.0K2ATP、10 EGTA、2.0磷酸肌酸二钠，KOH调至pH=7.4;⑥Ica，L细胞外液(mmol/L):1.0 Mg2Cl、2.0 CaCl2、5.0 HEPES、10葡萄糖、4.6 CsCl、10 TEA-Cl、140 Choline-Cl，KOH调至 pH=7.4;⑦Ito细胞外液(mmol/L):1.2 Mg2Cl、5.4 KCl、1.8 CaCl2、10.0 HEPES、10葡萄糖、0.15 CdCl2、0.33 NaH2PO4、136 Choline-Cl，CsOH调至pH=7.3。

1.2 分离大鼠心室肌细胞

本实验所用动物由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，体质量在250～300 g，均为SD雄性大鼠。以参考文献并对此方法加以改进后［4］，将大鼠心室肌细胞分离出来。大鼠在使用50 mg/kg戊巴比妥钠充分麻醉后，迅速开胸将心脏分离出来，利用Langenforf系统灌流心脏，将左右心房及心耳剪去。灌流液为含0.05 mmol/L CaCl2低钙酶解液，另含II型胶原酶0.4 mg/mL和蛋白酶 E 0.04 mg/ mL，整个灌流时间持续30～50 min，整个过程保持对心脏的不间断观察。每间隔5 min，将小块的心室肌剪下，在充分氧饱和的KB液中轻轻吹打，将单个心室肌细胞分离出来。对心室肌的形态和数量利用显微镜观察，将横纹清晰、边缘清晰、70%以上存活率细胞保持、备用。

1.3 利用全细胞膜片钳技术读取心肌细胞电流

室温下，利用 Hamill标准全细胞膜片钳方法［5］，记录边缘清晰、横纹清晰的单个细胞通道电流。开始实验前制备薄壁电极，此过程中使用到p-97玻璃电极拉制仪(美国sutter公司)。另外，对电极尖端利用MF-830抛光仪(日本Narishige公司)进行抛光，灌注电极内液后，将入液电阻维持在1.5～2.0 MΩ之间。此外，实验中还利用Axopatch 700B膜片钳放大器(美国Axon公司)，数据的记录采用pClampex10.0软件(美国Axon公司)。在细胞破膜后，为维持细胞膜的稳定性，不断给予控制在-50～-60 mV的连续刺激，对整个实验过程中的细胞电容进行记录和计算，并将细胞间的电流密度进行比较。

刺激方案:①记录Ito:测试电位(Vt)=-40～60 mV，维持电位(VH)=-80 mV，阶跃10 mV，保持400 ms的钳制时间;②记录Ica，L:测试电位(Vt)=-60～60 mV，维持电位(VH)=-80 mV，阶跃10 mV，保持240 ms的钳制时间;③记录Ito和Ica，L通道的电压依赖性失活:将细胞膜电位维持在-70 mV，从-60～40 mV的范围内阶跃，同时给予10 mV的前刺激，刺激维持1000 ms，给予持续250 ms去极化至10 mv测试电压记录Ica，L通道的失活;将细胞膜电位维持在-90 mV，从-120～60 mV的范围内阶跃，同时给予10 mV的前刺激，将60 mv的测试电压维持300 ms，记录此过程中Ito通道的失活。横坐标为前刺激电压，纵坐标为峰电流与标准化最大电流的比值(I/Imax)，绘制稳态失活曲线，并用Boltzman方程拟合求出失活半电压(V1/2)和斜率k;记录Ito和Ica，L通道的时间依赖性失活:给予双脉冲刺激，维持在-90 mV的电压，同时为诱导Ito通道失活给予10 mV电压钳制脉冲，并持续250 ms，给予的钳制脉冲要控制在不同的时间间隔，并对不同时间点对应的Ito峰电流幅值I进行记录;采取双脉冲刺激，维持在-90 mV的电压，为诱导ICa，L通道失活，需给予2个同样的10 mV刺激并持续250 ms，将两刺激之间的差距维持在-70 mV间隔，对给予刺激的时间间隔逐渐延长，将第2次刺激对应的ICa，L峰电流记录下来。稳态失活后恢复曲线是依据I/Imax与时间之间的关系来构建的，同时恢复曲线的时间常数τ是以单指数方程为最佳拟合曲线所得到的。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 ICa，L通道受参松养心胶囊的影响

2.1.1 ICa，LI-V曲线受参松养心胶囊的作用结果 图1显示，本研究中记录所得到的大鼠心室肌细胞ICa，L是一组失活缓慢、激活快速的内向电流。用0.5%的参松养心溶液灌流10 min后，在-60 mV～50 mV的Vt范围内，ICa，L激活峰值电流密度从(-8.64+-2.43)pA/pF降为(-5.92+-2.15)pA/pF，抑制率为(31.85+10.25)%(n=10，P＜0.05)，电流密度-电压(I-V)曲线上移。

2.1.2 ICa，L通道的电压依赖性失活和失活后恢复受参松养心胶囊的影响 ICa，L通道的电压依赖性失活和失活后恢复均受到参松养心溶液的影响。使用0.5%参松养心溶液前，ICa，L通道失活的V1/2为(-27.53+3.032)mV，斜率因子 k为(4.274+ 0.613);而使用后，ICa，L通道失活的V1/2(-31.43+ 4.115)mV，与作用前比较差异有统计学意义(P＜0.05)，斜率因子k(4.080+0.393)，作用前后比较差异无统计学意义(P＞0.05)。恢复曲线的时间常数τ是以单指数方程为最佳拟合曲线所得，0.5%参松养心溶液作用前后的τ分别是(117.38+9.834)和(131.13+5.668)(n=10，P＜0.05)。由此可见，ICa，L通道稳态失活曲线在0.5%参松养心溶液的作用下呈现出左移的趋势(图2所示)，同时ICa，L稳态失活后的恢复缓慢(图3所示)。

2.2 Ito通道受参松养心胶囊的影响

2.2.1 ItoI-V曲线受参松养心胶囊的作用图4显示，细胞内外液将IK1被钾电流阻断后，利用Ito刺激方案记录到的激活Ito包括2种成分，即持续电流和峰值电流。用0.5%的参松养心溶液灌流10 min后，在-20 mV～60 mV的Vt范围内，ICa，L最大峰值电流密度下降，从(23.53+3.31)pA/pF降为(16.86+2.34) pA/pF，抑制率为 (28.33+ 10.59)%(n=8，P＜0.05)，I-V曲线下移。

2.2.2 Ito通道的电压依赖性失活和失活后恢复受参松养心胶囊的影响 Ito通道的电压依赖性失活和失活后恢复均受到参松养心溶液的影响。使用0.5%参松养心溶液前，Ito通道失活的 V1/2为(-15.67+0.745)mV，斜率因子k为(4.838+0.233);而使用后，Ito通道失活的V1/2(-27.84+1.625)mV，斜率因子k为(9.634+0.247)，作用前后V1/2和k差异均具有统计学意义(P＜0.05)。0.5%参松养心溶液可使Ito通道失活曲线左移，斜率因子变大(图5所示)。恢复曲线的时间常数τ是以单指数方程为最佳拟合曲线所得，0.5%参松养心溶液作用前后的τ从(14.15+0.584)增大到(18.90+1.106)(n=8，P＜0.05)，此结果说明Ito通道稳态失活后恢复在0.5%参松养心溶液的作用下变得缓慢。

图1 ICa，LI-V曲线受参松养心溶液的作用

图2 ICa，L通道稳态失活受参松养心溶液的影响

图3 ICa，L通道稳态失活后恢复受参松养心溶液的影响

3 讨论

心率失常是由心肌电生理发生紊乱造成的。心率失常的发病机制通常可以归结为异常的细胞膜离子泵结构与功能，或者是因低氧缺血造成的心肌细胞能量代谢障碍，从而影响细胞膜对离子的转运，改变了细胞内外各种离子的浓度、分布以及流动性，最终在电生理上表现为心肌细胞兴奋性、自律性和传导性的改变，也就是心率失常［6］。

图4 ItoI-V曲线受参松养心溶液的作用

图5 Ito通道稳态失活受参松养心溶液的影响

图6 Ito通道稳态失活后恢复受参松养心溶液的影响

ICa，L是引发细胞内钙释放引起心肌收缩偶联的主要离子流，影响着动作电位的时程［7］。然而，心肌缺血再灌注损伤的中心环节以及诱发缺血性心肌病的重要机制是细胞内钙超载。此外，心率失常发生的另一诱因就是动作电位复极不均一，可诱导跨心室壁不均一的复极，并在动作电位1期的形成中具有重要作用，导致另一重要离子流［8］Ito，它是具有快激活和失活特点的瞬时外向电流。目前临床上，抗心律失常的药物多是单离子通道抑制剂药物在实现抗心率失常作用的同时，可能会有致心率失常发生的潜在性，具有明显的副作用。与西药相比，抗心律失常中药不仅可以影响心脏离子通道的功能，而且由于中药的复合成分使得其具有多离子通道靶点的作用特点，因此副作用小毒性低。其中，参松养心胶囊是一种常见的抗心率失常的纯中药制剂，该方中多数药物均有较好的抗心率失常作用［9］，如丹参、黄连、桑寄生中的丹参酮和黄连素成分，可以实现对心肌细胞外钙离子内流的阻滞，发挥异搏定样作用;山茱萸中的氨基酸成分实现动作电位的延长，最终表现为心肌细胞自律性的降低。实验证明，参松养心胶囊对心率失常具有明显的疗效，但目前并没有对参松养心胶囊抗心律失常机制的报道［10］。本研究利用全细胞膜片钳记录方法，探究了参松养心胶囊对不同心肌离子通道的影响。

研究结果表明，0.5%的参松养心溶液对ICa，L和Ito均具有明显的抑制作用。具体来说，0.5%的参松养心溶液可以使ICa，LI-V曲线上移，使失活曲线的V1/2降低以及失活后恢复时间延长，说明0.5%的参松养心溶液抑制ICa，L的作用，是对ICa，L通道的电压依赖性失活和时间依赖性激活过程的门控影响来实现的。另外，0.5%的参松养心溶液可以降低Ito的峰值电流密度，I-V曲线下移，稳态失活曲线左移，通道的失活加速，通道失活后的恢复时间也被延长。本实验发现，0.5%的参松养心溶液对ICa，L和Ito的抑制作用，可能是参松养心胶囊具有明显抗心律失常作用而致心率失常副作用较小的原因之一。

综上所述，参松养心胶囊具有明显抗心律失常作用而致心率失常副作用较小，是一种较为理想的抗心律失常药物。但本研究仅在离体大鼠心肌细胞水平上分析参松养心胶囊的电生理作用，关于参松养心胶囊的药理作用还需要开展进一步的临床和动物实验，以揭示参松养心胶囊的安全性，为其广泛应用提供理论和实践基础。

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Inhibitory Effect of Shensong Yangxin Capsule on the L-type Calcium Current and Potassium Current in the Rat Ventricular Myocytes

CHEN Lin-zhong1，CHENG Yu-rong2，LI Qing1△
(1.No.1 Clinical Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China; 2.The affilited Beijing Chanyang Hospital of Capital Medical University，Beijing 100020，China)

Objective:Explore the inhibitory effect of Shensong Yangxin capsule on rat ventricular myocyte L-type calcium current(Ica，L)and transient outward potassium current(Ito).Methods:Using enzymatic hydrolysis to separated rat ventricular muscle cells，using Shensong Yangxin solution(0.5 mg/100 ml，0.5%)perfusion ventricular muscle cells，using whole cell patch clamp technique to record the Ica，L and Ito，the cell membrane within 20 min after record all data，for each cell to do self-reflection，before and after observation and Shensong Yangxin solution of Ica，L and the impact of Ito channel current.Result:0.5% Shensong Yangxin solution has inhibitory effect on Ica，L and Ito，in particular，and Shensong Yangxin solution of Ito slow current component itqs has no obvious effect，but can obviously inhibitory the Ito Itof the rapid current components.Under-10 mV test voltage，after 0.5%role and Shensong Yangxin solution，Ica，L biggest activated peak current density from(8.64+2.43)pA/pF reduced to(5.92+2.15)pA/pF，the inhibitory rate of(31.85%+31.85%)，current density and voltage(I-V)curves upward;Under 60 mV test voltage，after 0.5%of the role and shensong yangxin solution，Itof biggest activated peak current density from(23.53+3.31)pA/ pF is(16.86+2.34)pA/pF，the inhibitory rate of(28.33%+28.33%)，the i-v curve down.And Shensong Yangxin solution without changing the Ica，L channel dynamics，but can make the Ito channel after the deactivation of slow recovery.Conclusion:Shensong Yangxin solution has obvious inhibitory effect on Ica，L and Ito.

Shensong Yangxin capsule;L-type calcium current;Transient outward potassium current;Inhibition

R285.5

:B

:1006-3250(2015)07-0806-03

2015-01-11

程林忠(1964-)，男，山西晋城人，副主任药师，医学本科，从事药剂学的临床与研究。

△通讯作者:李 青(1965-)，男，山西塑州人，主任药师，医学博士，从事药学的临床与研究，Tel:18636680680，E-mail: liqing_1965@sohu.com。