疏血通脉胶囊预处理对ERK信号通路的脑缺血耐受诱导作用调控研究*

刘 泰，黄德庆，张元侃，胡跃强，梁 妮，胡玉英，何乾超，陈荣群，张青萍

(广西中医药大学第一附属医院，南宁 530023)

疏血通脉胶囊预处理对ERK信号通路的脑缺血耐受诱导作用调控研究*

刘 泰，黄德庆，张元侃，胡跃强，梁 妮，胡玉英，何乾超，陈荣群，张青萍△

(广西中医药大学第一附属医院，南宁 530023)

目的:研究ERK信号通路在脑缺血耐受诱导中的作用，观察疏血通脉胶囊预处理对其调控作用。方法:对大鼠行3 min脑缺血预处理，诱导其产生脑缺血耐受，24 h后建立脑缺血再灌注模型(缺血预处理组)，观察ERK/P-ERK的变化情况，并与假手术组、缺血再灌注组、疏血通脉胶囊组及PD98059组进行比较，检测各组神经元凋亡数量，观察ERK/P-ERK与神经元凋亡的相关性。结果:缺血预处理组及疏血通脉胶囊组P-ERK表达水平均明显上调，同时神经元凋亡数量减少，与缺血再灌注组比较差异有统计学意义。腹腔注射ERK抑制剂PD98059后，大鼠P-ERK表达水平受到明显抑制，神经元凋亡数量增加，并加重神经功能缺损情况。结论:脑缺血预处理能够减少脑缺血再灌注后神经元凋亡，改善神经功能，其机制可能与ERK信号通路激活有关，疏血通脉胶囊预处理可能通过激活该通路起到脑保护作用。

脑缺血预处理;脑缺血再灌注;疏血通脉胶囊;ERK信号通路

脑缺血耐受是一种强有力的内源性神经保护机制，可提高神经细胞对缺血性损害的抵抗力［1］。研究发现，中药诱导脑缺血耐受形成有着独到的优势。疏血通脉胶囊是广西中医药大学第一附属医院刘泰教授的经验方，前期研究发现其对缺血性脑血管病有较好的疗效［2-4］，但其预处理能否提高脑缺血耐受能力目前尚未明确。本研究以细胞外信号调节激酶(extracellular signa1-regulated kinases，ERK)为切入点，研究ERK信号通路在脑缺血耐受诱导中的作用，并观察疏血通脉胶囊预处理对其的调控作用。

1 材料与方法

1.1 抗体和主要试剂

ERK1/2、P-ERK1/2(pTyr204/Thr202)抗体购自美国 Affinity公司，Tunel凋亡试剂盒购自德国Roche公司，蛋白酶K购自美国Sigma公司，PVDF膜购自Millipore公司，其余主要试剂购自碧云天生物公司。

1.2 实验药物

疏血通脉胶囊由三七15 g、薤白10 g、地龙10 g、栝楼皮10 g、冰片0.1 g等组成，药物购自柳州神农医药公司，由广西中医药研究院制备，每克含生药5 g。ERK抑制剂PD98059购自美国Sigma。

1.3 模型建立与分组

健康成年雄性SD大鼠200只(许可证号sYXK桂2009-0002)，体质量220～250 g，按随机数字表法分为假手术组、缺血再灌注组、预缺血组、疏血通脉组和PD98059组各40只。假手术组只分离动脉不插线;缺血再灌注组、疏血通脉组、PD98059组均参照改良Longa法［5］建立大脑中动脉闭塞再灌注模型。预缺血组大鼠先预缺血3 min，恢复灌注24 h后建立缺血再灌注模型。造模前，疏血通脉组参照《现代医学实验动物学》，按380 mg/kg制成混悬液灌胃;PD98059组以 1 mg/kg剂量腹腔注射PD98059，2组给药均为14 d。其余3组给予等量蒸馏水灌胃，术中死亡大鼠及时补充。

1.4 取材与处理

术后清醒大鼠根据Zea Longa 5分制标准评分，再灌注后3 h、6 h、24 h、72 h按随机数字表法分为4个亚组，每亚组10只大鼠，取大脑梗死区皮层，一部分放入-80℃冰箱保存，进行ERK、P-ERK检测。另一部分置于4%甲醛溶液中固定保存，用于神经元凋亡检测。

1.5 免疫印迹法检测ERK、P-ERK的表达水平

每孔取20 μL蛋白样品上样行凝胶电泳，完成后进行转膜，100 V恒压进行45 min。TBS洗膜后，封闭液封闭1 h，加一抗4℃孵育过夜，次日用TBST洗膜3次后，加二抗室温孵育1 h。TBST再洗3次，超敏发光液反应1 min，压片、显影、定影，内参按此方法进行检测。扫描条带光密度值并进行分析，以P-ERK与ERK的比值(P-ERK/ERK)表示ERK磷酸化水平，即ERK通路激活程度。

1.6 TUNEL法检测神经元凋亡

脱蜡后用4%的多聚甲醛室温固定15 min，将组织切片放入0.01 M枸橼酸钠缓冲溶液，置于微波炉加热5 min至沸腾，室温冷却后PBS洗3次;加反应混合液37℃反应1 h，PBS室温浸洗2次;加Converter-POD反应液37℃反应30 min;PBS室温浸洗2次后加DAB显色液室温反应约10 min，冲洗后脱水、封片，400倍光镜镜检。

1.7 统计学方法

使用SPSS 17.0进行统计分析，多组间均数比较采用单因素方差分析，方差齐则行LSD(L)检验，方差不齐则取Tamhane’s T2检验结果，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能缺损评分

表1显示，除假手术组外，其余4组均出现不同程度的神经功能缺损并逐渐加重，于24 h达到高峰;预缺血组、疏血通脉组各时间点均轻于缺血再灌注组及PD98059组，差异有统计学意义(P＜0.05);同时，缺血再灌注组各时间点神经功能缺损均轻于PD98059组，差异有统计学意义(P＜0.05);预缺血组与疏血通脉组各时间点比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 各组大鼠脑缺血再灌注后各时间点神经功能缺损评分情况(±s)

表1 各组大鼠脑缺血再灌注后各时间点神经功能缺损评分情况(±s)

注:与假手术组比较:*P＜0.05;与缺血再灌注组比较:△P＜0.05;与PD98059组比较:▲P＜0.05，☆P＜0.05

组别 例数3 h 6 h 24 h 72 h假 手 术 组10 0 0 0 0缺血 再灌 注 组 10 2.00±0.47＊☆ 2.20±0.63＊☆ 2.50±0.53＊☆ 2.30±0.48＊☆预 缺 血 组 10 1.10±0.32＊△▲ 1.50±0.53＊△▲ 1.70±0.48＊△▲ 1.30±0.48＊△▲疏 血 通 脉 组 10 1.20±0.42＊△▲ 1.30±0.48＊△▲ 1.60±0.52＊△▲ 1.10±0.32＊△▲PD 9 8 0 5 9组 10 2.50±0.53* 2.70±0.48* 2.90±0.32* 2.70±0.48*

2.2 免疫印迹检测

表2图1显示，各组大鼠P-ERK/ERK情况，除假手术组及PD98059组外，其余各组从3 h即出现ERK通路的明显激活并逐渐升高，于24 h达到高峰，各时间点与假手术组及PD98059组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。预缺血组、疏血通脉组各时间点磷酸化水平均高于缺血再灌注组，差异有统计学意义(P＜0.05)。各时间点预缺血组与疏血通脉组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

表2 各组大鼠脑缺血再灌注后各时间点梗死区P-ERK/ERK情况(±s)

表2 各组大鼠脑缺血再灌注后各时间点梗死区P-ERK/ERK情况(±s)

注:与假手术组比较:*P＜0.05;与缺血再灌注组比较:△P＜0.05，;与PD98059组比较:▲P＜0.05，☆P＜0.05

组别 例数3 h 6 h 24 h 72 h假 手 术 组10 0.40±0.02 0.42±0.02 0.48±0.04 0.43±0.06 10 0.31±0.06 0.33±0.08 0.35±0.06 0.33±0.08缺 血 再 灌 注 组 10 0.81±0.12＊☆ 0.91±0.18＊☆ 1.31±0.14＊☆ 1.03±0.16＊☆预 缺 血 组 10 1.21±0.18＊△▲ 1.25±0.18＊△▲ 1.73±0.24＊△▲ 1.55±0.09＊△▲疏 血 通 脉 组 10 1.16±0.17＊△▲ 1.32±0.19＊△▲ 1.84±0.20＊△▲ 1.63±0.22＊△▲PD 9 8 0 5 9 组

图1 24 h各组P-ERK以及ERK的表达情况

2.3 神经元凋亡情况

图2显示，各时间点假手术组偶见极少量凋亡细胞，其余各组随脑缺血再灌注时间的延长，凋亡数量逐渐增加，并于24 h时达到高峰，预缺血组与疏血通脉组各时间点神经元凋亡数量均较缺血再灌注组少，差异有统计学意义(P＜0.05)，但预缺血组与疏血通脉组比较差异无统计学意义(P＞0.05); PD98059组各时间点神经元凋亡数量均多于缺血再灌注组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表3 各组大鼠神经元凋亡情况(±s)

表3 各组大鼠神经元凋亡情况(±s)

注:与假手术组比较:*P＜0.05;与缺血再灌注组比较:△P＜0.05;与PD98059组比较:▲P＜0.05，☆P＜0.05

组别 例数3 h 6 h 24 h 72 h假 手 术 组 10 2.40±0.52 2.50±0.53*2.00±0.82 2.10±0.74缺 血 再 灌 注 组 10 21.00±4.77＊☆ 26.60±7.09＊☆ 82.60±9.56＊☆ 68.3±9.52＊☆预 缺 血 组 10 14.00±4.35＊△▲ 20.30±4.83＊△▲ 47.30±7.30＊△▲ 42.90±5.20＊△▲疏 血 通 脉 组 10 15.80±5.09＊△▲ 18.20±5.29＊△▲ 45.30±6.93＊△▲ 40.40±6.08＊△▲PD 9 8 0 5 9 组 10 36.20±6.12* 43.60±6.17* 98.60±8.77* 79.90±9.16*

图2 24 h时间点各组神经元凋亡情况

3 讨论

ERK是丝裂酶原活化蛋白激酶家族的一员，ERK激活后可降低脑缺血再灌注损伤NMDA受体活性，抑制Ca2+内流，发挥神经元保护作用［6］。本研究结果提示，脑缺血预处理可明显减少大鼠脑缺血再灌注后神经元凋亡数量，改善神经功能，有明确的脑保护作用。同时我们观察到，预缺血组大鼠ERK信号通路被激活，表现为P-ERK/ERK比值显著上升，并于24 h时达到高峰，72 h仍可观察到明显的磷酸化表达，这与国外文献报道结果是一致的［7］。而ERK抑制剂PD98059可使大鼠P-ERK表达水平受到明显抑制，神经元凋亡数量增加，并加重神经功能缺损。本研究发现，ERK激活具有神经保护作用，抑制ERK磷酸化加重了神经功能缺损情况，提示脑缺血耐受的产生与ERK通路的激活有关，脑缺血再灌注后该信号通路的激活可能是机体应激时的自身保护反应。

缺血性脑血管病属于中医学“中风”范畴，刘泰总结前人经验及结合自己的经验，认为“痰瘀互结”是中风病的关键病机，因此提出“化痰祛瘀”法是缺血性脑血管病防治的重要治法［8-9］，并自拟疏血通脉胶囊治疗中风，方中三七、薤白为君药，化痰祛瘀通络;地龙、栝楼皮为臣药，协同君药加强活血祛痰作用;冰片为佐使药，开窍醒神，清热止痛，共奏化痰息风、祛瘀通络、痰瘀同治、疏血通脉之功。现代药理研究表明，所选药物具有良好的改善脑循环、降血脂、抗氧化和细胞凋亡、保护神经等作用［9］。本研究提示，预先给予大鼠疏血通脉胶囊灌胃，能够明显减少大鼠脑缺血再灌注损伤后神经元凋亡的数量，改善神经功能，同时能够显著提高P-ERK的表达水平，提示疏血通脉胶囊预处理可能通过激活ERK信号通路诱导脑缺血耐受的发生，从而发挥脑保护作用。

本研究结果提示，ERK信号通路参与脑缺血耐受的形成，疏血通脉胶囊可能正是通过激活该信号通路起到诱导脑缺血耐受、发挥脑保护作用。这为药物预处理诱导脑缺血耐受产生以及中医“治未病”思想提供实验基础，同时也为“化痰祛瘀”法治疗中风提供实验依据。

［1］Blanco M， Lizasoain I， Sobrino T， et al. Ischemic preconditioning:a novel target for neuroprotective therapy［J］.Cerebrovase Dis，2006，21(Suppl2):38.

［2］刘泰，韦必清，韦玉进.醒脑通脉胶囊对脑缺血再灌注损伤神经细胞凋亡的影响［J］.辽宁中医杂志，2005，32(2):89.

［3］刘泰，秦若飞，张青萍，等.醒脑通脉胶囊对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑后织IL-1β、IL-6和IL-8含量的影响［J］.广西医科大学学报，2008，25(1):1-4.

［4］刘泰，谭璐璐，秦若飞，等.醒脑通脉胶囊对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠TNF-a的影响［J］.广西中医学院学报，2008，10(4):13-16.

［5］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84-91.

［6］Nicole O，Ali C，Docagne F，et al.Neuroprotection mediated by glial cell line-derived neurotrophic factor:Involvement of a reduction of NMDA-induced calcium influx by the mitogenactivated protein kinase pathway［J］.J Neursci，2001，21(9): 3024-3033.

［7］Choi JS，Kim HY，Cha JH，et al.Ischemic preconditioninginduced activation of ERK1/2 in the rat hippocampus［J］.Neurosci Letters，2006，409(3):187-191.

［8］梁妮，刘泰.醒脑通脉胶囊的中医理论探源［J］.时珍国医国药，2008，19(7):1706.

［9］刘泰，张志伟.疏血通脉胶囊中医理论探源［J］.时珍国医国药，2012，23(9):2295-2297.

Regulatory Research of Shuxuetong Capsule Preconditioning on Cerebral Ischemic Tolerance Induced by ERK Signaling Pathway

LIU Tai，HUANG De-Qing，ZHANG Yuan-Kan，HU Yue-Qiang，LIANG Ni，HU Yu-Ying，HE Qian-Chao，CHEN Rong-Qun，ZHANG Qing-Ping△
(The First Affiliated Hospital of Guangxi University of TCM，Nanning 530023，China)

Objective:To explore the function of ERK(extracellular-signal regulated kinas)signaling pathway in the induction of brain ischemic tolerance，and observe the function of Shuxue Tongmai capsule pretreatment.Methods:Ischemic preconditioning was performed for three minutes on the rats to induce the cerebral ischemic tolerance.Rat model of cerebral ischemia reperfusion(the ischemia pretreatment group，I/R group)was established 24 hours later.Western blot was used to detect the protein expression of ERK and P-ERK(phosphorylation extracellular-signal regulated kinas)，comparing the expression with the sham operation group，I/R group and Shuxue Tongmai capsule group and PD98059 group.TUNEl method was applied to detect the apoptosis of neurons and we also study the relationship between expression of ERK，P-ERK and the apoptosis of neurons.Results The expression of PERK in ischemia preconditioning group increased significantly and the apoptosis of neurons quantity declined.It was significantly to the I/R group.After given the PD98059，the ERK inhibitor，the expression level of P-ERK was restrain significantly and the apoptosis of neurons deteriorate significantly.Conclusion:Ischemia preconditioning can decrease the apoptosis of neurons in cerebral ischemia reperfusion，and improve neurologic function.Its mechanism related to the activation of the ERK signaling pathway.Shuxue Tongmai capsule pretreatment can protect the cerebral by the ERK signaling pathway.

Cerebral schemic preconditioning;Cerebral ischemia reperfusion;Shuxue Tongmai capsule;ERK signaling pathway

R285.5

:B

:1006-3250(2015)07-0797-03

2015-03-10

广西自然科学基金资助项目-疏血通脉胶囊预处理对脑缺血大鼠MAPKs通路的影响研究(2011GXNSFA018180);广西攻关项目-缺血性中风新药——疏血通脉胶囊的临床前研究(桂科攻11107009-1-11)

刘 泰(1959-)，男，广西桂林人，主任医师，医学学士，广西名中医，从事脑血管疾病的中西医结合临床与研究。

△通讯作者:张青萍(1969-)，男，河北人，副主任医师，医学硕士，从事脑血管疾病的中西医结合临床与研究，Tel:0771-5848502，E-mail:liutai590216@163.com。