柴苓汤对环孢素A肾病大鼠MCP-1、TNF-a的调控作用*

黄晋红，潘秋霞，张城浩，王香婷，3，王聪慧，魏 民

(1.武警河北总队医院，石家庄 050081;2.河北医科大学，石家庄 050017; 3.河北中医学院，石家庄 050200)

柴苓汤对环孢素A肾病大鼠MCP-1、TNF-a的调控作用*

黄晋红1，潘秋霞2，张城浩2，王香婷2，3，王聪慧2，魏 民3△

(1.武警河北总队医院，石家庄 050081;2.河北医科大学，石家庄 050017; 3.河北中医学院，石家庄 050200)

目的:观察柴苓汤对慢性环孢素A肾病大鼠单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)及肿瘤坏死因子-a(tumour necrosis factor-a，TNF-a)的影响，探讨炎症反应在环孢素A肾病中的作用及柴苓汤的调控机制。方法:采用经口灌服环孢素A［30 mg/(kg·d)］的方法复制慢性环孢素A肾病大鼠模型，同时给予柴苓汤［3 g/(kg·d)］及缬沙坦［10 mg/(kg·d)］治疗共28 d，摘取肾脏观察肾脏病理变化。RT-PCR、免疫组化方法检测大鼠肾脏MCP-1、TNF-a蛋白及mRNA的表达。结果:病理显示模型组大鼠肾脏大量炎性细胞浸润，肾小管间质胶原成分明显增多，与对照组比较，MCP-I、TNF-a蛋白及mRNA表达显著增强。经柴苓汤及缬沙坦治疗，大鼠肾脏炎性细胞浸润及胶原沉积均减轻，MCP-I及TNF-a高表达被显著下调。结论:柴苓汤可减轻炎症损伤，减少ECM沉积，从而延缓慢性CsA肾病纤维化进程。

柴苓汤;环孢素A肾病;MCP-1;TNF-a

环孢素 A(cyclosporine A，CsA)是一种强有效的免疫抑制剂，主要用于器官移植及自身免疫性疾病的治疗。自20年前应用于器官移植以对抗排斥反应以来，大大提高了移植器官及病人的生存率，但肾毒性限制了其临床应用。临床数据显示，应用CsA 10年以上的患者基本都表现出不同程度的慢性肾脏损伤［1］。CsA肾病(chronic cyclosporine A nephropathy，CCN)的发病机制极其复杂，与肾素-血管紧张素系统(RAS)、一氧化氮(NO)、氧化应激、上皮细胞表型转化等因素有关。我们的前期研究显示，柴苓汤可以改善CsA肾病大鼠肾功能，抑制肾小管上皮细胞表型转化，诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖，具有肾脏保护作用［2-4］。研究同时发现，动物模型中，炎性细胞浸润和炎性介质表达明显，考虑炎症反应在CCN中起重要作用。本研究采用CsA慢性肾病模型，通过观察柴苓汤对炎性介质TNF-a及趋化因子MCP-1的影响，探讨炎症反应在CCN中的作用及柴苓汤的调控机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

40只8周龄雌性清洁级SD大鼠，体质量(200±10)g，河北医科大学动物实验中心提供(动物合格证号SCXK(冀)2013-1-003)。按随机数字表法分为对照组、模型组、缬沙坦组、柴苓汤组各10只。

1.2 药物及试剂

柴苓汤颗粒型3 g/袋，由柴胡、黄芩、半夏、人参、甘草、生姜、大枣、猪苓、桂枝、白术、茯苓、泽泻组成，购自日本 TSMURA株式会社(No:114)。环孢素软胶囊由华北制药股份有限责任公司提供(批号FJC1401002)，用橄榄油将其配制成质量浓度为15 mg/mL的溶液备用。缬沙坦由桂林华信制药有限公司提供(批号140209)。RT-PCR主要试剂:DEPC (Sigma，E174);RNAiso Plus(TaKaRa，Code No:9108)，RT Reagents(TaKaRa，Code No:62120A)，PCR Reagents (TaKaRa，Code No:R004A)，DNA Marker(TaKaRa，Code No:3427A)。MCP-1(Santa Cruz Biotechnology，sc-1785)，TNF-a(Santa Cruz Biotechnology，sc-1350)，免疫组化试剂盒(VECTASTAIN ABC KIT，PK-4005)。

1.3 主要仪器

LEICA RM2245石蜡切片机(莱卡上海分公司)、高速冷冻离心机1-15K(美国 Sigma公司)、OLYMPUS全能显微镜BX-UCB(日本OLYMPUS公司)、凝胶图像分析系统(Scion Image 4.0.3.2图像分析系统)、756MC型紫外-可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)、PE9600型PCR扩增仪(美国PE公司)、电泳仪及电泳槽(北京六一)、紫外透射仪(北京鼎国)、超低温保存箱(MDF-382E，日本SANYO)。

1.4 造模及给药

40只大鼠适应性饲养 1周后，参考相关文献［5］，模型组、缬沙坦组及柴苓汤组给予 CsA 30 mg/(kg·d)溶解于橄榄油经口灌服，复制环孢素A肾病大鼠模型，对照组经口灌服等容量橄榄油;造模同时缬沙坦组给予缬沙坦10 mg/(kg·d)，柴苓汤组给予柴苓汤3 g/(kg·d)(相当于成人剂量20倍)，灌胃给药，对照组和模型组每日给予等容量生理盐水共28 d。实验动物于第29天断头处死，切取肾脏，4%多聚甲醛固定用于免疫组化，部分肾组织-70℃保存用于提取RNA及蛋白。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 组织学检查 3 um的石蜡切片，行HE、Masson染色，光学显微镜下观察病理改变。

1.5.2 免疫组化检测MCP-I、TNF-a蛋白表达

采用 ABC法，切片厚3 μm，脱蜡;PBS浸洗 5 min，用滤纸将组织周围的水分吸干;3%过氧化氢，室温下孵育20 min;PBS清洗3次，每次5 min;枸橼酸缓冲液(pH 6.0)微波炉内修复，98℃维持 10 min;冷却至室温;PBS清洗3次，每次5 min;滴加非免疫性血清封闭，室温孵育30 min;加入一抗4℃过夜，PBS清洗3次，每次5 min;滴加生物素标记的二抗，室温60 min，PBS清洗3次，每次5 min;滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素，37℃孵育 30 min，PBS清洗3次，每次5 min;DAB显色1 min，光镜下控制细胞显色程度5～20 min;自来水充分冲洗，终止显色;苏木素复染细胞核;常规酒精逐级脱水，二甲苯透明，树胶封片。以镜下出现棕黄色颗粒为阳性表达，以PBS替代二抗作为阴性对照。

1.5.3 RT-PCR检测MCP-I、TNF-a mRNA表达 100 mg肾脏组织按试剂盒说明提取RNA，用TE Buffer稀释后于紫外分光光度计260和280 nm及320 nm处读取OD值，OD260/OD280=1.7-2.1间方可使用，总RNA浓度=(OD260-OD320)×稀释倍数×0.04(ug/ul)。用前调整为1 ug/ul，取2ul总RNA用反转录试剂反转成cDNA。TNF-alpha上游引物:5'-TAC ACT GGC CCG AGG CAA CA-3'，下游引物:5'-GGG CAA GGG CTC TTG ATG GC-3'，扩增片段为582bp;MCP-1上游引物:5'-ACA GAC AGA GGC CAG CCC AG-3'，下游引物:5'-TCT CCA GCC GAC TCA TTG GGA-3'，扩增片段为215bp;18S上游引物:5'-CAC GGT GTC ACC CAG ACC CG-3'，下游引物:5'-AGC AGA GGC AGT GGC AGA CT-3'，扩增片段为273bp。取cDNA 2 μL，加入引物2 μL、缓冲液5 μL，dNTP 5 μL、taq酶1/8 μL，加双蒸水至50 μL。扩增条件:变性:94℃30 s;退火:55℃ 30 s;延伸:72℃ 30 s，循环30次。使用Gene Amp PCR系统9700(USA)扩增。最后取20 μL扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，于紫外灯下拍照，将胶片上的反应条带在Scion Image 4.0.3.2图像分析系统中分析。18S相对含量用相同PCR反应中光带的强度来衡量mRNA在基因应答中的表达，实验重复3次。产物电泳后，紫外灯下拍照，用凝胶图像分析系统进行分析，以相应的内参电泳条带作为参照，结果以两者之积分吸光度比值表示。

1.6 统计学方法 使用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，数据资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 肾组织病理形态学观察

HE染色结果显示，对照组大鼠肾脏结构未见异常，肾小管上皮细胞排列整齐，间质无水肿，偶见炎性细胞浸润。模型组肾小管上皮细胞变性、浊肿、脱落，肾间质可见大量炎性细胞浸润。2治疗组肾间质有轻度炎性细胞浸润。Masson染色结果显示，对照组结构清晰，肾小球/肾小管基底膜及肾间质可见少量胶原成分。模型组肾小管间质胶原成分显著增多，主要表现在肾间质。缬沙坦组及柴苓汤组肾间质胶原成分较模型组明显减少(图1、2)。

2.2 各组大鼠免疫组化检测结果比较

图3、4显示，对照组大鼠肾组织MCP-I及TNF-a呈弱阳性，模型组大鼠MCP-I及TNF-α蛋白水平较对照组明显增强(P＜0.05)，呈深黄或黄褐色，主要表达于肾小管上皮细胞内。经治疗，缬纱坦组、柴苓汤组大鼠MCP-I及TNF-a蛋白表达显著减少(P＜0.05)。

图1 各组大鼠肾脏炎性细胞浸润情况

图2 各组大鼠肾脏间质胶原沉积情况

图3 免疫组化染色示各组大鼠肾脏MCP-1蛋白表达

2.3 各组大鼠RT-PCR检测结果比较

图5表1显示，与对照组比较，模型组大鼠MCP-1及TNF-a mRNA表达明显增强(P＜0.05)。2用药组大鼠MCP-1、TNF-a mRNA表达较模型组明显降低(P＜0.05)。

3 讨论

炎性损伤是慢性疾病持续进展中的关键因素，抗炎治疗成为新的靶点［6］。炎症反应在CsA肾病早期即出现并持续存在于疾病全过程［7］。许多数据显示，炎性损伤先于纤维化出现，是慢性肾脏疾病包括CCN病起病及发展的主要因素［8］。

图4 免疫组化染色示各组大鼠肾脏TNF-a蛋白表达

图5 各组大鼠肾脏MCP-1及TNF-a mRNA表达

表2 各组大鼠肾脏MCP-1及TNF-a mRNA表达比较(±s)

表2 各组大鼠肾脏MCP-1及TNF-a mRNA表达比较(±s)

注:与对照组比较:*P＜0.05;与模型组比较:■P＜0.05

组别MCP-1 mRNA TNF-a mRNA对 照 组95.33±6.11 141.00±18.68模 型 组 159.00± 8.54* 219.33±11.02*缬 沙 坦 组 140.67±14.74＊■ 183.00±10.54＊■柴 苓 汤 组 128.00± 5.57＊■ 174.00± 5.29＊■

应用CsA后肾脏内毛细血管收缩，微循环障碍，使肾组织缺血、缺氧继而激活肾脏固有细胞产生，分泌炎性细胞和炎性介质，如TNF-a、IL-1及趋化因子MCP-1等，炎症趋化因子促使大量单核细胞和巨噬细胞在肾小球、肾小管间质聚集，浸润的炎性细胞一方面产生大量致纤维化因子，直接参与肾纤维化［9］;另一方面又分泌炎性介质，形成瀑布反应，使炎性细胞浸润和慢性炎症持续存在。持续存在的炎症反应导致成纤维细胞分泌大量胶原进行损伤修复，胶原的生成增加而降解减少，大量胶原成分异常沉积于细胞外，造成肾纤维化。

TNF-a是公认的直接炎性因子，参与多种生理和免疫过程，刺激系膜细胞表达黏附分子、血管活性肽等细胞因子，并刺激成纤维细胞增生，促进胶原纤维的沉积［10］。MCP-1属于趋化因子CC亚家族，主要功能是趋化和激活单核细胞至炎症部位，还可活化并促进血管平滑肌细胞、肾小管上皮细胞等固有细胞产生炎症因子，进一步放大间质的炎症反应。

本实验组织病理学显示，应用CsA后小管间质大量炎性细胞浸润，胶原沉积较多，蛋白及基因检测表明，模型组大鼠肾脏组织MCP-1及TNF-a的表达均明显增强，说明炎性反应参与了慢性环孢素A肾病进程，介导了纤维化的发生。

CCN属于中医学“水肿”、“腰痛”、“癃闭”、“淋证”、“关格”等疾病范畴。CsA作为免疫抑制剂在器官移植术后发挥积极治疗作用的同时，作为“药毒”壅积于肾，成为新的致病因素。“大毒治病，十去其六，无使过之，伤其正也”(《素问·五常政大论》)。药毒伤肾，肾气亏虚，蒸腾气化功能失职，不能泄浊排毒，湿浊溺毒蓄积体内，酿为浊毒。日久损伤肾腑，形成“微小癥瘕”瘀阻肾络，终致真元虚损，阴阳失调，开合失司，脏腑衰败。我们认为这是由外毒(环孢素A)伤肾产生的内毒(浊毒)，据此确立泻浊解毒的基本治则，解毒以祛除损害因素，泻浊以排出内生之毒。

根据治则我们选择具有泻浊解毒、通利三焦功效的柴苓汤作为治疗药方。柴苓汤由《伤寒杂病论》中的“小柴胡汤”和“五苓散”组合而成，可利小便，使内生浊毒有出路;疏利三焦使排毒管道通畅，气机条达。目前柴苓汤主要用于治疗水液代谢障碍性疾病、自身免疫性疾病，可增效减毒、改善生活质量。临床上柴苓汤用于治疗多种肾病并取得了较好疗效［11-13］。本研究组针对应用CsA的病人采用柴苓汤防治，可明显减轻症状，降低蛋白尿，保护肾功能。柴苓汤的主要有效成分是柴胡皂甙-d，可以抑制炎症反应和纤维化因子，起到肾脏保护作用［14-15］。实验表明，柴苓汤可下调 a-SMA的高表达，通过抑制肾小管上皮细胞的表型转化，减缓肾间质纤维化的进程［2］，并通过诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖，恢复细胞凋亡与增殖平衡而发挥肾脏保护作用［3-4］。

本实验结果显示，柴苓汤干预后，炎性细胞浸润及炎性介质表达明显减轻，胶原沉积较少，说明柴苓汤可通过抑制炎症反应延缓CCN纤维化进程，而炎症反应介导纤维化发生的途径还需要进一步探讨。

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Regulation Effect of Chailing Decoction on MCP-1，TNF-a of the Cyclosporine A Aephropathy Rats

HUANG Jin-hong1，PAN Qiu-xia2，ZHANG Cheng-hao2，WANG Xiang-ting2，3，WANG Cong-hui2，WEI Min3△
(1.Hebei Provincial Corps Hospital，Chinese People’s Armed Police Forces，Shijiazhuang 050081，China;2.Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China;3.Hebei University of Chinese Medicine，Shijiazhuang 050200，China)

Objective:To observe the effect of Chailing Decoction(CLD)on monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)and tumour necrosis factor-α(TNF-α)in rats with chronic cyclosporine A nephropathy(CCN)for investigating the function of inflammation and regulatory mechanism of CLD.Methods:The CCN rat models were prepared using oral administration of cyclosporine A(30 mg·kg-1·d-1).Meanwhile，they were treated with CLD(3 g·kg-1·d-1)and valsartan(10m g·kg-1·d-1)by gastrogavage for 28 days respectively.The kidneys were harvested on the 29th day and observed the pathology changes.The protein and gene expressions of MCP-I and TNF-a were observed using RT-PCR and immunohistochemical assay.Results:Renal pathology showed the inflammatory cell infiltration and collagen deposition in the renal interstitial area of CsA group was significantly increased.Compared with the control group，the protein and mRNA expressions of MCP-I and TNF-a of CsA group were significantly enhanced，and the high levels were down-regulated after treatment.Conclusions:CLD could retard the progress of CCN renal interstitial fibrosis by alleviating inflammation and reducing the deposition of ECM.

Chailing decoction;Cyclosporine A nephropathy;MCP-1;TNF-α

R285.5

:B

:1006-3250(2015)07-0812-04

2015-02-18

河北省自然科学基金资助项目(H2014206284)

黄晋红(1964-)，女，主任医师，医学学士，从事中医病证基础研究。

△通讯作者:魏 民(1969-)，男，副教授，医学硕士，从事肾脏病的基础研究，Tel:0311-89926793，E-mail:wm5375@163.com。