黄芪甲苷对关节不稳诱导型小鼠膝骨关节炎的保护作用*

赵永见，薛纯纯，王利波，李晓锋，施 杞，王拥军，舒 冰△

(1.上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032;2.上海中医药大学脊柱病研究所，上海 200032)

黄芪甲苷对关节不稳诱导型小鼠膝骨关节炎的保护作用*

赵永见1，2，薛纯纯1，2，王利波1，2，李晓锋1，2，施 杞1，2，王拥军1，2，舒 冰1，2△

(1.上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032;2.上海中医药大学脊柱病研究所，上海 200032)

目的:观察黄芪甲苷能否缓解膝骨关节炎的病理改变。方法:将小鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组和黄芪甲苷组，实验组通过关节不稳术造成小鼠膝骨关节炎模型，并分别给予生理盐水和黄芪甲苷腹腔注射8周。取左侧膝关节进行三维重建和组织学染色。结果:模型组小鼠膝关节半月板钙化明显增加，关节软骨变薄，II型胶原明显减少，破坏明显，边缘骨赘形成;黄芪甲苷组均有明显改善。结论:黄芪甲苷可以减轻关节不稳诱导的小鼠膝骨关节炎病理改变。

膝骨关节炎;黄芪甲苷;软骨退变

膝骨关节炎是一种常见的慢性退行性疾病，临床上表现为关节疼痛、关节活动受限甚至关节功能丧失、病理改变以进行性膝关节软骨丢失、关节缘骨赘生成、滑膜炎症和增生、半月板钙化为特点［1］。由于该病发病率高、迁延难愈，严重影响到患者的生活质量［2］。

半月板是位于膝关节股骨和胫骨关节表面之间的半环形纤维软骨结构，其主要生理功能是在膝关节运动或者静态受压时缓冲并分散压力，具有维持膝关节稳定性和润滑关节的作用。前交叉韧带起于股骨外髁的内侧面，止于胫骨髁间嵴之间，是维持膝关节稳定性的重要结构。临床上半月板和前交叉韧带损伤可导致关节失稳、压力缓冲失常、关节表面受压增大且分布不均，关节软骨功能异常发生退变。因此，通过给小鼠膝关节进行内侧半月板联合前交叉韧带离断术，可以模拟膝关节不稳，诱导骨关节炎的发生［3］。

施杞教授总结出气血不足为本病发病之本，气滞血瘀为病机之关键，提出“益气化瘀、标本兼顾”的治疗法则。黄芪为补气圣药，临床常重用黄芪治疗此类疾病，疗效显著。黄芪甲苷是黄芪的主要有效组分之一，研究发现其具有抗炎、调节免疫的药理学作用［4］。我们通过给予小鼠膝关节进行内侧半月板联合前交叉韧带离断术，模拟膝关节不稳，诱导膝骨关节炎的发生，体内验证黄芪甲苷是否对关节不稳诱导的膝骨关节炎具有保护作用。

1 材料与方法

1.1 小鼠膝骨关节炎模型制备

12周龄雄性野生型C57/B6小鼠20只分为模型组与黄芪甲苷组，每组10只。将小鼠以氯胺胴(0.5 mg/10 g体质量)腹腔注射麻醉，左膝关节内侧备皮，碘伏消毒，以膝关节胫骨平台水平为中心，沿胫骨内侧做2 cm纵形切口，离断内侧副韧带，沿胫骨平台打开膝关节腔。仔细游离出内侧半月板，从中间离断，并进一步离断前交叉韧带，关闭关节腔，缝合筋膜和皮肤［5］。取10只雄性野生型C57/B6小鼠作为假手术对照组，左侧膝关节内侧做皮肤切开并缝合。术后小鼠自由活动，常规饮食饲养。

1.2 药物干预

术后第2天起，将黄芪甲苷与玉米油溶解后配成10 m g/ml，实验组小鼠按每只每次0.1ml/10 g/d腹腔注射8周。黄芪甲苷标准品(CAS:83207-58-3)购自上海药检所上海东方药品科技实业有限公司。模型组和假手术组分别给予等体积玉米油腹腔注射。

1.3 取材与标本处理

药物干预8周后，将小鼠以氯胺酮麻醉处死，取出左侧膝关节，剔除周围肌肉结缔组织，在10% NBF(VWR)中固定2 d，去离子水冲洗。

1.4 Micro-CT扫描及三维重建分析

用SCANCO Micro-CT80对固定好的小鼠膝关节进行扫描，电压55 kV，电流72 uA，以10 um的断层厚度扫描500个层面。以300 ms积分时间进行2D重建，以230～1000阈值范围进行3D重建。

1.5 组织形态学观察

将固定后的膝关节以蚁酸脱钙液脱钙9 d，梯度酒精常规脱水，二甲苯透明后石蜡包埋。于胫骨平台内侧处切取4 μm厚失状位连续切片。切片烤片后分别经二甲苯中脱蜡，梯度乙醇脱蜡至水后进行阿尔辛兰/橙黄G染色。切片分别经过1%盐酸/乙醇30 s，1%阿尔辛兰/苏木素30 min，1%盐酸/乙醇2 s，0.5%氨水15 s，95%乙醇1 min，橙黄G/伊红染液(0.5%橙黄+2%伊红)1.5 min。再经过梯度乙醇脱水、二甲苯透明后封片，光学显微镜下观察分析膝关节病理改变。

1.6 免疫组织化学染色方法

切片经过二甲苯和梯度酒精常规脱蜡至水，4%中性多聚甲醛固定15 min，PBS冲洗后，3%过氧化氢(H2O2)浸泡10 min去除内源性过氧化物酶，PBS冲洗，以10 mg/ml蛋白酶K常温消化10 min以进行抗原修复。5%山羊血清封闭30 min，以兔抗II型胶原抗体(Abcam，ab34712)4℃孵育过夜，阴性对照用PBS代替I抗。PBS反复冲洗后，1∶200山羊抗兔二抗室温孵育30 min，PBS冲洗后滴加抗生蛋白链菌素-辣根过氧化物酶孵育30 min，PBS冲洗，DAB显色剂显色3 min，清水冲净，苏木素复染后盐酸酒精分化、氨水返蓝，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。棕色染色为阳性表达，无着色为阴性。

2 结果

2.1 膝关节三维重建

假手术组膝关节胫骨平台内侧光滑平整，内侧半月板处可见形状规则的楔形钙化组织。术后8周，模型组膝关节胫骨平台内侧边缘骨赘生成，内侧半月板处骨组织明显增大，且形状不规则。黄芪甲苷组胫骨平台内侧边缘稍有骨赘生成和，内侧半月板骨组织增大较模型组减轻(图1)。

2.2 膝关节组织病理学改变

阿尔辛兰/橙黄G染色淡蓝色示软骨组织，橙黄色示骨组织。假手术组膝关节软骨深层染色较深，浅层染色稍浅，关节软骨表面光滑平整，细胞排列整齐。半月板形态规则外周为软骨组织，内部可见少量钙化骨组织。术后8周，模型组膝关节软骨表面破损，软骨层明显变薄，软骨细胞排列紊乱，关节软骨边缘骨赘形成，半月板及内部钙化组织均明显增大，且形态不规则。黄芪甲苷组膝关节软骨表面稍有不平，软骨层轻微变薄，表层染色减少，软骨边缘骨赘形成有限，内侧半月板及内部钙化组织稍有增大(图2)。

2.3 膝关节软骨II型胶原表达

免疫组化显示，假手术组膝关节软骨深层II型胶原染色丰富，表层染色稍浅，分布均匀。模型组膝关节软骨II型胶原染色明显变薄，以表层丢失为主。黄芪甲苷组膝关节软骨II型胶原染色稍有减少，但仍具有表层浅染、深层深染、染色连续性的特点，表层染色稍有不均匀(图3)。表明模型组膝关节软骨基质中的II型胶原显著降低，黄芪甲苷组膝关节软骨基质中的II型胶原在表达水平和分布方式上均有改善。

图1 膝关节三维重建图

3 讨论

图2 膝关节阿尔辛兰/橙黄G染色

图3 膝关节II型胶原免疫组化染色

II型胶原是弹性软骨的主要细胞外基质，对于缓冲压力有着重要作用，同时它也是软骨细胞特有的分子标志［5］。在生理条件下，关节软骨维持着软骨特征，不向肥大软骨细胞分化，但在骨关节炎的关节软骨中，细胞外基质中的II型胶原和蛋白多糖降解，软骨细胞的特性发生变化，不能维持软骨组织的特征。

本研究通过离断小鼠膝关节内侧半月板和前交叉韧带，模拟膝关节不稳状态，诱导膝骨关节炎。膝关节的三维重建和组织学染色显示出典型的骨关节炎表现，包括关节表面破坏，软骨层变薄，软骨边缘骨赘生成，半月板钙化，II型胶原表达降低。

黄芪甲苷是黄芪的重要生理活性成分，常作为黄芪药材的定性定量指标。黄芪甲苷的主要药理作用包括抗炎抗病毒、免疫调节作用［6］，抗氧化、缺氧及缺氧/复氧损伤［7-8］引起的细胞损伤。针对骨关节炎研究发现，黄芪甲苷对佐剂型大鼠膝骨关节炎有一定的保护作用［9］，其机制可能与抑制炎症因子白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNFα)的表达［10-11］，进而抑制软骨细胞凋亡和细胞外基质降解有关［12-13］。据此我们推测，黄芪甲苷可能通过抑制软骨细胞炎症反应，抑制细胞外基质降解，并促进软骨细胞增殖及合成细胞外基质，部分缓解关节不稳诱导的膝骨关节炎的发生。

［1］Nuki G.Osteoarthritis:a problem of joint failure［J］.Z Rheumatol，1999，58(3):142-147.

［2］余卫，徐苓，秦明伟，等.北京市城区老年人膝关节骨关节炎流行病学调查—与美国白种人膝关节骨关节炎的临床和X线比较分析［J］.中华放射学杂志，2005，39(1):67-70.

［3］Kamekura S，Hoshi K，Shimoaka T，et al.Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability［J］.Osteoarthritis Cartilage，2005，13 (7):632-641.

［4］Lai PK，Chan JY，Cheng L，et al.Isolation of anti-inflammatory fractions and compounds from the root of Astragalus membranaceus［J］.Phytother Res，2013，27(4):581-587.

［5］Yang CL，Rui H，Mosler S，et al.Collagen II from articular cartilage and annulus fibrosus. Structuraland functional implication of tissue specific posttranslational modifications of collagen molecules［J］.Eur J Biochem，1993，213(3):1297-1302.

［6］段立军，孙博航.黄芪甲苷的研究进展［J］.沈阳药科大学学报，2011，28(5):410-416.

［7］李丽，陶辉宇，陈杰斌，等.黄芪甲苷保护阿霉素心肌损伤的抗氧化机制研究［J］.临床儿科杂志，2007，25(1):58-61.

［8］杨富国，刘革新，王力.黄芪甲苷对缺氧/复氧损伤血管内皮细胞核转录因子-κB表达的影响［J］.中国中西医结合急救杂志，2007，14(6):367-369.

［9］Wang B，Chen MZ.Astragaloside IV possesses antiarthritic effect by preventing interleukin 1β-induced joint inflammation and cartilage damage［J］.Arch Pharm Res，2014，37(6):793-802.

［10］汤晓晨，俞峰，孙书龙，等.黄芪甲苷对人膝骨关节炎退变关节软骨IL-1β表达的影响［J］.南京中医药大学学报，2013，29(1):48-52.

［11］Goldring MB，Birkhead JR，Suen LF，et al.Interleukin-1 betamodulated gene expression in immortalized human chondrocytes［J］.J Clin Invest，1994，94(6):2307-2316.

［12］Blanco FJ，Ochs RL，Schwarz H，et al.Chondrocyte apoptosis induced by nitric oxide［J］.Am J Pathol，1995，146(1):75-85.

［13］刘维统，王跃，郝鹏，等.黄芪甲苷对关节软骨细胞功能影响的实验研究［J］.实用医院临床杂志，2009，6(4):44-47.

Protective Effect of the Astragalus IV on the Knee Osteoarthritis Induced by Joint Instability in Mice

ZHAO Yong-jian1，2，XUE Chun-chun1，2，WANG Li-bo1，2，LI Xiao-feng1，2，SHI Qi1，2，WANG Yong-jun1，2，SHU Bing1，2
(1.Longhua Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China; 2.Spine Research Institute，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China)

Objective:to observe the effect of Astragaloside on the pathological changes of knee osteoarthritis.Methods:mice were randomly divided into sham group，model group and Astragaloside IV group.Mice in model group and Astragaloside IV group were performed surgery in left knee joints to induce knee osteoarthritis，and were treated with saline and Astragaloside IV respectively.After 8 week-treatment，the left knee joints were harvested for Micro-CT scanning and reconstruction and pathological observation.Results:obvious meniscus ossification，thinner articular cartilage with cracks and decreased Type II collagen staining，and osteophyte at the edge of articular cartilage were developed in the left knee joints of model group.Changes of articular cartilage and meniscus in Astragaloside IV were clearly better than model group.Conclusion:Astragaloside IV could alleviate articular cartilage degeneration in knee osteoarthritis mice model.

knee osteoarthritis;Astragaloside IV;cartilage degeneration

R684.3

B

1006-3250(2015)06-0668-03

2015-01-06

上海市自然科学基金青年项目(12ZR1450400)-BMP2在软骨细胞退变中的作用及益气化瘀中药调节BMP/Smad信号通路抑制软骨细胞退变的研究;上海高校青年教师培养资助计划(ZZSZY12064)-黄芪甲苷调节BMP/Smad信号通路抑制软骨细胞退变的研究;国家自然科学基金青年基金(81403239)-肾性骨病方调节BMP/Smad信号通路防治肾性骨病的研究;国家教育部“创新团队”发展计划(IRT1270)-中医“肾主骨”理论的应用基础研究;上海中医药大学“085工程”中医药学一流学科建设项目(085ZY1204)-中医“肾藏精”及“肾主骨”理论的临床与基础研究;上海高校实验技术队伍建设计划(LH01.24.001)

赵永见(1983-)，男，山东临沂人，检验师，医学学士，从事中医药防治骨与软骨退行性病变的临床与研究。

△通讯作者:舒 冰，女，助理研究员，E-mail:shubing523@ hotmail.com。