大黄鱼(Larimichthys crocea)补体C3和C4基因的分子特征及表达分析*

王海玲　祁鹏志　郭宝英　吴常文

(浙江海洋学院　国家海洋设施养殖工程技术研究中心　舟山　316022)

大黄鱼(Larimichthys crocea), 又称石首鱼、黄花鱼、红瓜等, 隶属于鲈形目、石首鱼科、黄鱼属, 为我国传统“四大海产”(大黄鱼、小黄鱼、带鱼、乌贼)之一。大黄鱼主要分布于南海雷州半岛以东至黄海南部西侧, 范围涵盖南海、东海和黄海南部, 结群生活于亚热带近海中下层。大黄鱼是我国沿海一种重要的海洋经济鱼类养殖品种之一, 也是我国主要的网箱养殖海水鱼类(Wanet al, 2009)。近年来, 随着大黄鱼人工养殖技术的不断完善和成熟, 大黄鱼养殖也在水产养殖中产生了巨大的经济和社会效益。但是,也出现了诸如养殖品质低、生长衰退、抗病能力弱等问题, 严重制约了大黄鱼养殖业的健康发展(Zhenget al, 2006)。对大黄鱼先天免疫的研究将会对大黄鱼的疾病控制起到重要的作用。近年来, 随着分子生物学技术的不断发展, 越来越多的大黄鱼免疫相关基因被克隆出来(Zhenget al, 2006; Wanet al, 2009; Qianet al, 2013)。随着许多经济鱼类基因组计划的成功完成, 对基因开展 mRNA水平上的研究也变得越来越重要(Davidsonet al, 2010; Smithet al, 2013;Venkateshet al, 2014)。目前, 本实验室即国家养殖设施与工程技术中心已经联合上海交通大学 Bio-X研究中心对大黄鱼基因组图谱成功进行了绘制, 对大黄鱼开展基因水平上的研究已刻不容缓。

大黄鱼由于其重要的经济价值, 近年来在我国的养殖面积日益增加, 但病害问题严重, 其中溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是养殖大黄鱼弧菌病的主要病原之一。因此, 有必要对溶藻弧菌侵染后大黄鱼的免疫反应进行研究, 以期为大黄鱼的免疫学研究及健康养殖提供一定理论依据。免疫系统是保护鱼体免受病原微生物入侵的防御系统(艾庆辉等, 2007), 也是鱼类维持正常生理功能的保障。免疫系统主要由免疫组织及器官、免疫细胞和体液免疫因子组成。鱼类是最早同时出现特异性免疫和非特异性免疫的脊椎动物。与哺乳类相比, 其特异性免疫系统不发达, 因此鱼类更多依赖非特异性免疫来抵御病害生物的入侵以及修复感染损伤的机体。而非特异性免疫主要由一些抗氧化酶如超氧化物歧化酶、磷酸酶及补体C3、C4 参与(Lvollet al, 2006; 区又君等, 2011; Yuet al,2011)。在补体各成分中, 补体第三组分(C3)在血清中含量最高, 是补体系统的核心。 C3是哺乳动物补体系统中最重要的组成部分, 是激活和效应中心, 补体系统的三大激活途径均汇集于 C3, 然后产生相应的效应。C3也与旁路途径的激活起始有关, 旁路途径属于自发性激活, 一种称为C3的“慢速运转”(tick over)机制(Müller-Eberhard, 1988)。C3在功能上不仅依赖的阳性反馈环路的基础; 而且 C3裂解片段及其结合蛋白复杂多样, 在免疫防御、免疫调控以及免疫病理中发挥着重要的作用(翟瑞燕等, 2010)。

补体是鱼类免疫防御系统的重要组成成分, C3参与形成靶细胞表面攻膜复合物(MAC), 导致靶细胞溶解。C3的存在通常可作为补体系统中旁路激活途径存在的一个依据。C3是个包含硫酯的蛋白, 相对于补体系统中的其它组成部分而言, C3没有非常清晰的结构区域, 但它的系统发生可以追溯到原口动物——刺胞动物、节肢动物和两侧对称动物(Fujitoet al, 2010; Buresovaet al, 2011)可以认为C3是补体系统进化过程中最早出现的分子。在哺乳动物中, C3与C4、C5 同源, 这三个分子与血清蛋白酶抑制因子α 2M(α-2-macroglobulin)以及血细胞的 GPI锚定膜蛋白CD109 (Linet al, 2002)同属于一个家族——硫酯包含蛋白家族。目前, 已经在低等的后口动物乃至原口动物中克隆获得C3的cDNA序列, 部分有了功能上的研究结果(Clowet al, 2004; Zhuet al, 2005)。在按蚊和果蝇中均发现硫酯包含蛋白 TEP, 据报道, 这些分子拥有类似于脊椎动物 C3的调理作用, 它们作为调理素参与病原菌的清除(Bou Aounet al, 2011;Poveloneset al, 2011)。

1　材料与方法

1.1　材料

一龄大黄鱼 5尾, 取自福建沙埕港, 体重约 700g/尾, 活体运输到实验室, 取脑、肌肉、肝脏、脾脏、心脏、鳃、肠和胃这 8个组织迅速投入液氮中保护RNA并转移至－80°C冰箱中保存备用。提取上述8个组织的总 RNA并反转录成 cDNA, 用于大黄鱼补体C3(L.c-C3)和补体C4(L.c-C4)基因的克隆扩增及组织表达谱检测。

不同胚胎发育阶段的大黄鱼, 采自福建省福鼎市沙埕养殖基地, 是在大黄鱼卵受精后每1h、3h、7h、12h、17h、24h后采样, 分别对应大黄鱼胚胎发育的2细胞期、多细胞期、原肠初期、眼泡出现期、尾芽期、初孵仔鱼, 并用光学显微镜进行确认。

一龄大黄鱼(500—700 g/尾)共 36尾, 健康无伤病, 于循环水族箱中暂养一周以上。饲养期间投喂新鲜小杂鱼。分为对照组和诱导组两组, 每组 18尾。诱导组于腹腔内注射溶藻弧菌 200μL(PBS重悬, 细胞数约为1.0×107个), 对照组注射PBS 200μL。分别于注射后0h、6h、12h、24h、48h和72h采样, 每组每次随机挑取 3尾, 解剖取肝脏和脾脏两个组织,于液氮中速冻后保存于－80°C超低温冰箱, 用于诱导后不同时间点的表达变化分析。

1.2　L.c-C3和L.c-C4基因克隆及全长cDNA的获得

大黄鱼基因组草图已经由浙江海洋学院国家海洋设施养殖工程技术研究中心联合上海交通大学Bio-X研究中心联合绘制完成(Wuet al, 2014), 利用该基因组数据, 作者已得到L.c-C3和L.c-C4基因的全长。

总 RNA提取采用 TRIZOL(美国 Invitrogen公司)试剂, 提取方法参照说明书。琼脂糖电泳检测提取效果(图1), 然后用DNase I酶于37°C消化30 min以去除残留的DNA。用Poly(T)18和Power Script Transcriptase(Clontech)将消化后的总RNA反转录成cDNA。

图1　琼脂糖电泳检测RNA提取效果Fig.1　RNA examination by agarose gel electrophoresis

1.3　序列分析

采用ORF finder软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/)对L.c-C3和L.c-C4基因cDNA全长序列进行开发阅读框(ORF)预测。采用SMART (Simple Modular Architecture Research Tool) (http://smart.gemblheidelberg.de/)和 SignalP 4.0程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignaIP/)分别进行结构域分析和信号肽分析。利用 CLUSTALW X2软件进行氨基酸序列的多重比对。采用MEGA 4.0软件比较不同序列之间的相似度并构建系统发育树, 树形分支置信度通过开展1000次自举重复得到。

1.4　荧光定量检测大黄鱼 L.c-C3和 L.c-C4基因mRNA的表达特征分析

分别取3条健康大黄鱼(脑、肌肉、肝脏、脾脏、心脏、鳃、肠和胃)共 8种不同组织检测L.c-C3和L.c-C4基因mRNA的组织差异性表达、取不同胚胎发育阶段(2细胞期、多细胞期、原肠初期、眼泡出现期、尾芽期和初孵仔鱼)共 6个时期的大黄鱼受精卵检测不同发育阶段中L.c-C3和L.c-C4基因mRNA的差异性表达、取溶藻弧菌侵染的大黄鱼(每一取样时间点的实验组和对照组鱼各 3尾)肝脏和脾脏组织,分别抽提以上各组织的总RNA。总RNA提取、DNase I处理和第一链cDNA合成等方法详见文献(黄左安等,2011)。根据L.c-C3和L.c-C4基因的cDNA序列分别设计一对跨内含子的扩增引物, 选取β-actin作为内参基因。各引物序列详见表1。

表1　用于实时定量荧光PCR的引物序列Tab.1　Primers used for RT-PCR

荧光定量检测试剂采用 SYBR定量检测试剂盒(Takara公司), 实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)采用25μL 反应体系,含 SYBR Premix ExTaq (2×)缓冲液 12.5μL, 正向和反向引物(10μmol/L)各 1μL, 模板0.5μL, 灭菌水 10μL。扩增反应在Applied Biosystems 7500P荧光定量PCR仪上进行, 94°C变性180s后, 按以下程序进行 40 个循环: 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s。为确保特异性扩增, PCR结束后对扩增产物进行熔解曲线分析, 流程为 94°C 30s, 72°C 60s, 95°C 30s,每一个样品技术重复3次。采用β-actin基因对各个样本L.c-C3和L.c-C4基因表达水平进行校正, 每个样本的检测均重复 3次, 并测量其 Ct值。采用相对标准曲线法2–ΔΔCt(Livaket al, 2001)分析相对定量结果, 实验结果表示为平均值±标准误, 显著性水平采用 SPSS18.0软件中的单因素方差分析(One-way ANOVA)进行统计,P＜0.05为差异显著。

2　结果与分析

2.1　L.c-C3和L.c-C4基因cDNA序列分析

L.c-C3基因 cDNA序列全长 4962个核苷酸(nucleotides, nt) (GenBank登录号: KJ544508), 编码一个由1653个氨基酸组成的前体蛋白。前体蛋白N端23个氨基酸为信号肽序列。利用SMART 数据库对结构域开展检测分析显示, 大黄鱼 C3蛋白由一个信号肽部分和8个结构域组成(图2B所示), 详细信息见表2。将L.c-C3基因氨基酸序列与其它硬骨鱼以及人类的C3序列比对后(图1)表明,补体C3存在多个保守位点, 其中包括一个α-β折叠位点(RXXR结构,660—663aa, 如图2A), 一个 ANATO 结构域(由CC……C……C……CC构成, 686—722aa, 如图2C)和一个极保守的硫酯区(GCGEQ, 1005—1009aa, 图2C),L.c-C3与鱼(Miichthys miiuy)C3的同源性最高(序列相似度为 82%), 而与其它硬骨鱼类如牙鲆(Paralichthys olivaceus)、点带石斑鱼(Epinephelus coioides)、金头鲷(Sparus aurata)和花狼鱼(Anarhichas minor)的序列相似度分别为73%、73%和72%而与非洲爪蟾(Xenopus laevis)的相似度为43%, 与尤金袋鼠(Macropus eugenii)的为 42%, 与人(Homo sapiens)的则为41%。系统发育分析显示大黄鱼补体C3与鮸鱼最先发生聚类, 表明亲缘关系最近, 鱼类 C3和哺乳动物C3分别形成两个不同的枝系, 在鱼类C3中大黄鱼与鱼C3首先聚类, 然后再与其它鱼类的C3发生聚类(图3)。

L.c-C4基因cDNA序列全长5088个核苷酸(已经提交到GenBank), 编码一个由1695个氨基酸组成的前体蛋白。前体蛋白 N 端 19 个氨基酸为信号肽序列。大黄鱼C4蛋白同样也是由一个信号肽部分和 8个结构域组成(如图4A所示)。就结构域组成来看,L.c-C3和L.c-C4基因具有相同的结构域, 只是在序列中的位置不同, 详细信息见表3。

将L.c-C4基因氨基酸序列与其它硬骨鱼以及人类的C4序列比对后表明,L.c-C4同样与鱼(Miichthys miiuy)C4具有最高的同源性(序列相似度为92%), 而与其它硬骨鱼类如雀鲷(Stegaste spartitus)、尼罗口孵非鲫(Oreochromis niloticus)和红鳍东方鲀(Takifu gurubripes)的序列相似度分别为65%、63%和62%。系统发育分析显示大黄鱼补体C4也首先与鮸鱼发生聚类, 表明亲缘关系最近, 鱼类C4和哺乳动物C4同样分别形成两个不同的枝系, 在鱼类中, 大黄鱼 C4与鱼C4首先聚类, 然后再与其它鱼类C4发生聚类,如图5。

图2　A. L.c-C3多重序列比较α-β链折叠位点部分; B. 大黄鱼补体C3分子结构域分析图; C. L.c-C3多重序列比较ANATO结构域和硫酯区Fig.2　A. α-βfolding sites of L.c-C3 of multiple sequence; B. Molecular structural domain of L.c-C3; C. ANATO structural domain and thioester domain of L.c-C3 of multiple sequence

表2　SMART数据库预测的大黄鱼C3结构域Tab.2　Prediction to the structural domain of L.c-C3 by SMART database

2.2　L.c-C3和L.c-C4基因表达特性

L.c-C3 mRNA的组织表达特异性荧光定量检测结果如图6所示, 在图6中可以看到L.c-C3在大黄鱼脾脏、心脏、肌肉、鳃、胃、肠、脑、肝脏这8种组织中均有表达, 其中在肝脏中的表达量特别高, 而在其它7种组织中都只有微量表达, 在这些微量表达的组织中, 脾脏和肠中的表达量相对高一些。

L.c-C4 mRNA的组织表达特异性荧光定量检测结果如图6所示, 如图6所示, 肝脏和肌肉中L.c-C4 mRNA的表达量明显高于其它组织, 说明L.c-C4 mRNA主要在肝脏和肌肉中表达, 其次是在胃、脾脏和鳃中表达。

L.c-C3 mRNA在胚胎时期各个阶段的表达特征如图7所示。由图7可知,L.c-C3在胚胎时期的表达量并无明显变化, 而在每个时期都有一定量的表达,在其它鱼中也存在这种现象, 对鳕鱼(Gadus morhua)(Langeet al, 2004)、牙鲆(Paralichthy solivaceu) (Langeet al, 2006)和虹鳟(Oncorhynchus mykiss) (Lvollet al,2007)的研究表明 C3在多种器官和幼鱼发育的不同时期均有表达。经过用SSPS软件进行的数据统计分析显示也是如此, 在组织表达差异中, 用单因素方差分析检测得出大黄鱼肝脏中C3的表达量是其它组织的成百上千倍(P＜0.01), 其它各种组织中都有表达,但无明显差异, 在大黄鱼胚胎发育的不同时期中,L.c-C3的表达量并无明显差异, 单因素方差分析检测得P＞0.05, 说明各个阶段的表达差异并不明显。

图3　通过邻近相连法构建的补体C3的系统发育树Fig.3　The phylogenetic tree of C3 constructed by Neighbor-Joining method

图4　A. 经SMART分析, L.c-C4共包含的8个结构域; B. L.c-C4多序列比对后其中ANATO结构域部分以及硫酯区部分的结果Fig.4　A. Eight domains in L.c-C4 by SMART analysis; B. ANATO structural domain thioester domain of L.c-C4 of multiple sequence

L.c-C4 mRNA在胚胎时期各个阶段的表达特征如图7所示, 在图中可以清楚地看到L.c-C4 mRNA的表达量在眼泡出现期、尾芽期、初孵仔鱼三个阶段中的表达量明显高于前三个阶段。这说明在大黄鱼胚胎发育的早期L.c-C4表达量不高, 但是随着胚胎发育,在眼泡出现期表达量明显提高。

2.3　被溶藻弧菌侵染后L.c-C3和L.c-C4基因表达变化

大黄鱼被溶藻弧菌侵染后L.c-C3 mRNA在肝脏、脾脏中的表达变化如图8A所示, 在图8中可以看到大黄鱼在被溶藻弧菌侵染后6h和48h的时候肝脏中L.c-C3的表达量明显提高, 而在脾脏中则是在被侵染后的 12h和 24h的时候明显提高。在肝脏中L.c-C3的表达量水平在健康的大黄鱼中表达量较其它组织要高很多, 但是在溶藻弧菌感染实验中, 对照组中L.c-C3的表达量相对于感染后的L.c-C3的表达量, 要低的多。肝脏中L.c-C3在被溶藻弧菌侵染后表达量是明显上升的, 这说明肝脏是合成补体 C3的主要器官, 也是遇到外界细菌侵染后发生免疫反应的效应器。但是在6h和48h时主要在肝脏中表达, 而在12h和24h时主要在脾脏中表达, 这可能是多种原因综合作用造成的。

表3　SMART数据库预测的大黄鱼C4结构域Tab.3　Prediction of the structural domain of L.c-C4 by SMART database

大黄鱼被侵染溶藻弧菌后L.c-C4 mRNA在肝脏、脾脏中的表达变化如图8B所示, 可以看出,L.c-C4 mRNA在肝脏中的变化并不明显, 只有在被溶藻弧菌侵染后48h时, 较其它时间段的表达量升高明显。而在脾脏中在被侵染后的 6h以后的各个时间段L.c-C4 mRNA的表达量都有明显的升高, 造成这个结果的原因可能是由于L.c-C4在健康大黄鱼的脾脏中表达量比较少, 一旦受到外界细菌的刺激, 表达量就会明显升高。

图5　通过邻近相连法构建的补体C4的系统发育树Fig.5　The phylogenetic tree of C4 was constructed by Neighbor-Joining method

图6　L.c-C3 mRNA, L.c-C4 mRNA在各组织中表达特征Fig.6　Expression of L.c-C3 and L.c-C4 mRNA in different tissues

3　讨论

3.1　大黄鱼补体成分C3和C4的全长cDNA序列分析

本文利用大黄鱼基因组数据库, 获得了大黄鱼补体成分C3和C4的全长cDNA序列。序列分析表明, 大黄鱼C3和C4具有已知C3、C4特征性结构, C3和C4存在翻译后的N-糖基化修饰, 这与已报道的哺乳动物C3、C4结果一致。与哺乳动物相比, 鱼类补体系统的研究较晚, 直到进入20世纪80年代以后才开始(Doddset al, 1993)。由于C3在补体活化途径中的关键作用, 自从从人血清中分离得到第一个 C3分子后(Müller-Eberhardet al, 1960), 有关硬骨鱼类和其它物种C3结构和功能的研究报道日益增多。本文利用大黄鱼基因组数据库, 获得了大黄鱼补体成分C3和C4的全长cDNA序列。序列分析表明, 大黄鱼C3和C4与哺乳动物的C3、C4存在明显的相同和差异性。在结构上, 大黄鱼C3和哺乳动物C3一样, C3转化酶的剪切位点都是Arg-Ser; 都存在两条肽链(α链和β链), 并且α链上都存在硫酯部位; 与硫酯催化反应相关的残基都是组氨酸。在人C3中,Pro1007和Pro1020在形成稳定的硫酯键时是必不可少,Glu1128在决定硫酯结合的特异性方面起着重要的作用(Zarkadiset al, 2001), 在大黄鱼C3中也是如此。在所有脊椎动物的C3中, 处于催化部位、在功能上比较重要的残基主要是组氨酸, 但在某些同种异型中催化性组氨酸可被不同的残基所取代, 例如鲤 C3-S基因型中的丝氨酸、虹鳟C3-4基因型中的苏氨酸、鲤C3-Q1和 C3-Q2基因型中谷氨酰胺相应地取代了催化性组氨酸。研究表明, 高等动物和低等动物不仅在氨基酸序列方面存在差异, 而且在C3受体特异性、C3对热的敏感性以及C3的溶血活性方面也不同(Alsenzet al,1992; Zarkadiset al, 2001)。但有关大黄鱼C3的功能尚有待进一步研究。

图7　L.c-C3 mRNA, L.c-C4 mRNA在大黄鱼胚胎时期各阶段的表达特征Fig.7　Expression characteristics of L.c-C3 and L.c-C4 mRNA in different phases of embryonic period

图8　A. 被溶藻弧菌感染后L.c-C3 mRNA在肝脏和脾脏中的变化; B. 被溶藻弧菌感染后L.c-C4 mRNA在肝脏和脾脏中的变化Fig.8　Effects of L.c-C3 mRNA in liver and spleen infected by V. alginolyticus; B. Effects of L.c-C4 mRNA in liver and spleen infected by V. alginolyticus

系统进化树分析表明, 鱼类 C3和 C4与哺乳类C3和 C4都分别形成各自的枝系, 大黄鱼 C3和 C4与鮸鱼的C3和C4最相似, 这与两者的在分类关系上亲缘关系最近的特点相一致。

3.2　L.c-C3和L.c-C4基因表达特性分析

组织表达特征研究揭示, 健康大黄鱼 C3和 C4基因mRNA在肝中表达量都很高, C4在肌肉中也有一定量表达, 但在肠、鳃、心脏、脑中只有少量表达。补体是鱼类抵抗微生物感染的重要成分, 激活后具有机体靶细胞溶解和调理作用, 而C3、C4是补体系统的主要成分。实验结果表明大黄鱼的肝脏中的补体C3、补体C4的含量最高, 其它的组织中也能检测出补体 C3、C4, 这与在鳕鱼(Gadus morhuaL)幼鱼(Langeet al, 2004)、庸鲽(Hippoglossus hippoglossusL)幼鱼(Langeet al, 2006)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)(Lvollet al, 2007)的结论相似, 说明肝脏是补体分泌主要部位。而多斑狼鱼(Anarhichas minorOlafsen)的补体C3仅在肝脏中表达(Ellingsenet al, 2005), 这可能与鱼种品种和生长环境有关。

胚胎发育过程中不同发育阶段的补体 C3和 C4表达特征的研究表明, 在其过程中补体 C3的表达量没有变化, 说明其在胚胎发育过程中很可能没有发挥作用, 而补体 C4在胚胎发育的后期阶段表达量明显提高, 这可能与即将要孵化面临外界的刺激有关。

3.3　经溶藻弧菌感染后的大黄鱼L.c-C3和L.c-C4基因表达特性分析

本文研究表明, 经溶藻弧菌侵染后, 肝组织中C3基因mRNA显著增加, 6h时达到峰值, 在12h和24h时, C3基因的mRNA在脾中的表达量显著增加,到48h时肝脏和脾脏中的C3表达量仍显著高于对照组, 在对照组的肝组织中, 在大黄鱼体内补体 C3的表达微量; 而在感染有溶藻弧菌的大黄鱼肝组织中,检测到L.c-C3大量表达。这说明受到病原体的侵袭,肝脏大量合成补体C3。在硬骨鱼类中, 已有研究表明,补体除了具有溶菌、中和外毒素(Sakai, 1984a, b)、溶解寄生虫(Bower, 1988)等直接的抗微生物作用外, 还显示出对吞噬细胞吞噬活性的促进作用, 即所谓调理作用。Buchmann(1998)发现补体C3可通过旁路途径杀死体内的寄生虫; Harris等(1998)曾报道虹鳟血清或黏液中的补体对体内的寄生虫具有杀伤作用;Matsuyama等(1992)证实鲤补体的调理作用是由于C3的作用而引起的。溶藻弧菌对鱼、虾、贝等都有较强的致病性, 溶藻弧菌的感染可引起大黄鱼产生鱼体发白, 体表点状发红, 下颌、眼球、腹部、以及各鳍基发红, 鳍条散列, 肝脏、肾脏、脾脏充血肿大。本研究利用RT-PCR技术显示感染溶藻弧菌的大黄鱼肝组织中存在补体 C3的表达明显上调, 因此推测L.c-C3在抗溶藻弧菌的感染中具有一定的作用, 但其对溶藻弧菌的作用途径有待深入研究。

受溶藻弧菌侵染后, 肝组织中C4基因的mRNA的表达量也有所增加, 但在脾脏中在12h以后都显著高于对照组, 揭示肝组织大量合成 C3, 脾脏中可以大量合成 C4。组织 RT-PCR显示正常状态下, 大黄鱼补体 C4 基因只在在肝和肌肉组织中表达量比较高, 这与哺乳动物的表达特征相同。在哺乳动物中,C3与C4、C5同源, 这三个分子与血清蛋白酶抑制因子α2M(α-2-macroglobulin)以及血细胞的 GPI锚定膜蛋白 CD109 (Linet al, 2002)同属于一个家族——硫酯包含蛋白家族。感染溶藻弧菌12h后, 大黄鱼的脾中补体C4基因表达明显提高, 说明大黄鱼补体C4对溶藻弧菌具有快速响应作用, 大量表达 C4以抵御溶藻弧菌的攻击。随着时间的推移, 大黄鱼补体 C4基因表达量也随之上升, 表现在感染72h后, 肝组织中基本停止表达有所降低, 而脾中表达量仍然很高(图8B)。由此推测, 大黄鱼补体C4在对抗溶藻弧菌的感染中具有重要作用, 但其对溶藻弧菌的作用途径还有待深入研究。

综上所述, 本文首次报道了大黄鱼补体成分 C3和C4基因的cDNA全序列, 并利用RT-PCR技术对其组织表达特异性, 不同发育阶段的表达变化, 以及感染溶藻弧菌的大黄鱼的肝脏和脾脏中的表达量变化与过程进行了相关研究, 为鱼类抗细菌免疫的深入研究奠定了基础。

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