海洋微生物酶研究进展

史翠娟, 闫培生, 赵瑞希, 韩 笑

哈尔滨工业大学(威海)海洋科学与技术学院,山东 威海 264209



海洋微生物酶研究进展

史翠娟, 闫培生*, 赵瑞希, 韩 笑

哈尔滨工业大学(威海)海洋科学与技术学院,山东 威海 264209

海洋中蕴含着丰富的微生物资源，海洋微生物逐渐成为新型酶制剂的重要来源。多种海洋微生物如细菌、放线菌和真菌能够产生活性酶。对海洋微生物来源的多糖酶、脂类水解酶、蛋白酶和漆酶等的研究进展进行了综述，以期为海洋微生物资源利用研究提供参考。

海洋微生物；多糖酶；脂类水解酶；蛋白酶；漆酶

海洋中有着极为丰富的微生物资源，随着海洋资源的进一步开发，与海洋微生物酶相关的研究逐渐增多，海洋微生物已成为开发新型酶制剂的重要来源。目前，在海洋细菌、古细菌、真菌和噬箘体等微生物中已经分离到多种具有开发潜力的活性酶，其中弧菌Vibriosp.是已报道的产酶种类最多的菌，来自弧菌的酶有蛋白酶、琼脂酶、几丁质酶和甘露聚糖酶等。目前来自深海和极地的极端微生物作为产酶资源也成为研究热点，低温酶、碱性酶和耐盐酶等结构和功能新颖的极端酶以其独特的催化作用大大拓宽了微生物酶的应用范围。本文将对海洋微生物来源的多糖酶、脂类水解酶、蛋白酶和漆酶等的研究进展进行综述，以期为海洋微生物资源利用研究提供参考。

1 多糖酶(polysaccharase)

1.1 淀粉酶(amylase)

淀粉酶是能将淀粉转化为低分子量化合物如葡萄糖、麦芽糖和寡糖的酶，广泛存在于动物、植物和微生物中。淀粉酶在淀粉工业的广泛用途使其在酶制剂市场占有最大的份额。目前微生物淀粉酶已经完全取代了传统的化学方法，应用于面包、果汁和酒类等多种食品的生产，在制药、环保和纺织等方面也有广泛应用。

根据pH稳定性不同，淀粉酶可以分为酸性、中性和碱性。根据耐热性可以将其分为高温、中温和低温淀粉酶3类。根据水解底物的专一性和产物的差异，可分为 α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、葡萄糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)、异淀粉酶(EC 3.2.1.9)和环状糊精葡聚糖转移酶(EC 3.2.1.19)等。

微生物淀粉酶产量高、制备简单、成本低，是目前工业用淀粉酶的主要来源。近年来海洋微生物淀粉酶的研究逐渐成为热点，已发现多种海洋细菌、放线菌和酵母菌具有淀粉酶活性，并且从部分菌中分离到淀粉酶，也有对淀粉酶基因克隆表达的研究。池振明课题组报道了几种海洋酵母菌，如解脂耶罗威亚酵母(Yarrowialipolytica)、平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)及普鲁兰短梗霉(Aureobasidiumpullulans)等均可以产生葡萄糖淀粉酶[1,2]。Liu等[3]从冲绳海域深海沉积物分离到α-淀粉酶高产菌株假单胞菌Pseudomonassp.K6-28-040，所产淀粉酶的分子量约为58 kDa，最适pH和最适温度分别为7.0和50℃。Shanmughapriya等[4]从海绵中分离到的海洋盐芽孢杆菌HalobacillushalophilusMMD047能够产生碱性淀粉酶，其最适pH为9.0，在40℃稳定，50℃以上酶活性明显下降。从深海热液口分离的超嗜热古菌ThermococcussiculiHJ21可以产耐高温的酸性α-淀粉酶，该酶最适温度为95℃，最适pH为5.0，酶基因已获得了克隆表达[5]。Selvin等[6]从海绵中筛选到一株诺卡氏菌NocardiopsisdassonvilleiMAD08，该菌株能同时产生胞外纤维素酶、脂肪酶及蛋白酶。李鹏等[7]从浙江舟山群岛海域潮间带海泥样中筛选到一株海洋放线菌玫瑰暗黄链霉菌(Streptomycesroseofulvus)，经诱变后淀粉酶活性明显提高。

1.2 琼脂酶(agarase)

根据作用方式不同，琼脂酶可分为α-琼脂酶(EC 3.2.1.158)和β-琼脂酶(EC 3.2.1.81)两类。α-琼脂酶裂解琼脂糖的α-l,3糖苷键，生成琼脂二糖等琼寡糖，而β-琼脂酶裂解琼脂糖的β-1,4糖苷键，生成的产物主要是新琼脂六糖、新琼脂四糖和新琼脂二糖等新琼寡糖[8]。琼脂主要存在于某些红藻的细胞壁中，因此琼脂酶在相关海藻的单细胞分离和原生质体制备等过程中可用于酶解细胞壁。琼脂酶在分子生物学试验中也被广泛应用，如从琼脂糖凝胶中回收DNA。另外，琼脂酶还被用于琼脂寡糖的制备，后者在食品生产、医药和化工领域都有重要用途。

目前所发现的琼脂酶大多为β-琼脂酶，α-琼脂酶很少，而且主要来自海洋细菌。现在已经报道的具有琼脂酶活性并且分离到琼脂酶的海洋细菌包括弧菌(Vibrio)[9]、交替单胞菌(Alteromonas)[10]、假单胞菌(Pseudomonas)[11]、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)[12]、芽孢杆菌(Bacillus)[13]和噬琼胶菌(Agarivorans)[14]等，另外还有海洋链霉菌(Streptomyces)[15]。Sugano等对海洋细菌Vibriosp.JT0107的琼脂酶进行了大量研究。该课题组先后从JT0107中纯化了β-琼脂酶和α-琼脂酶，并对酶性质、活性和基因序列等进行了分析。β-琼脂酶的分子量为107 kDa，最适pH 和温度分别为8.0和30℃；α-琼脂酶的分子量为84 kDa，最适pH和温度分别为7.7和30℃[9,16,17]。Ha等[18]将Pseudomonassp.W7的琼脂酶基因在E.coliJM83中表达，纯化的重组酶的分子量为59 kDa，最适pH为7.8，最适温度为20～40℃。

1.3 卡拉胶酶(carrageenanase)

卡拉胶酶是一种可降解硫酸多糖的半乳糖水解酶，通过降解卡拉胶的β-1,4糖苷键，生成偶数的卡拉胶寡糖。卡拉胶酶可用于制备卡拉胶低聚糖和寡糖，其降解海藻细胞壁卡拉胶的功能可用于研究细菌的卡拉胶代谢、DNA和蛋白质提取及原生质体制备等。

根据降解底物的专一性，卡拉胶酶主要分为ι-卡拉胶酶(EC 3.2.1.157)、κ-卡拉胶酶(EC 3.2.1.83)和λ-卡拉胶酶(EC 3.2.1.162)等3类。卡拉胶酶主要来源于海洋动物和海洋微生物，现己报道的产卡拉胶酶微生物绝大部分是海洋细菌，包括假单胞菌(Pseudomonas)[19]、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)[20]、噬纤维菌(Cytophaga)[21]、交替单胞菌属(Alteromonas)[22]和弧菌(Vibrio)[23]等。Weigl等[24]和Mclean等[25]均从海洋单胞菌(Pseudomonascarrageenovora)中分离纯化得到κ-卡拉胶酶，SDS-PAGE表明酶分子量为35 kDa，酶解产物为κ-卡拉二糖。Araki等[23]从海洋弧菌Vibriosp.CA-1004中分离纯化的κ-卡拉胶酶的分子量也为35 kDa，最适反应温度和pH分别为40℃和8.0，Pb2+和Zn2+等离子可完全抑制其酶活，降解产物主要为新κ-卡拉二糖和新κ-卡拉四糖。Barbeyron等[26]对来自Alteromonasfortis和Zobelliagalactanivorans的2种ι-卡拉胶酶进行了酶学性质和基因研究。结果表明，两种酶都专一性降解ι-卡拉胶底物，产物为新ι-卡拉四糖和六糖，并建立基因组文库克隆得到两个ι-卡拉胶酶基因。λ-卡拉胶酶发现的不多，Guibet 等[27]从假交替单胞菌(Pseudoalteromonascarrageenovora)分离到λ-卡拉胶酶，其蛋白大小为97 kDa，最适反应温度和pH分别为30℃和7.5，降解产物主要是新λ-卡拉四糖。

1.4 纤维素酶(cellulase)

纤维素酶是参与水解纤维素为葡萄糖的一组酶的总称，主要包括内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(EC 3.2.1.91)和β-葡萄糖苷(EC 2.1.21)，在3种酶的协同作用下，纤维素才能被水解成葡萄糖。利用纤维素酶可开发纤维素资源，目前已被广泛应用于食品、饲料、纺织和生物质能源等。

纤维素酶广泛存在于生物体中，但主要来自于微生物。已报道的产纤维素酶的菌大约有53个属，数千个菌株，但用于生产纤维素酶的菌株主要来自陆生真菌，如黑曲霉、嗜热子囊菌和瑞氏木霉等。对海洋来源的纤维素酶的研究最早见于海岸湿地红树林生态系统的微生物，现在已从海洋环境中分离到多种产纤维素酶的微生物[28]。

产纤维素酶的海洋细菌中，报道较多的是假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)[29,30]。熊鹏钧等[29]从西太平洋暖池深海底部5 000 m沉积物中分离到的假交替单胞菌Pseudoalteromonassp.DY3具有高内切葡聚糖酶活性，该酶的最适温度为40℃，最适pH为6～7。Lee等[31]从海水中分离到产纤维素酶的海洋细菌Bacillussubtilissubsp.subtilisA-53，其产纤维素酶的最佳碳氮源为米糠和酵母提取物，最适培养温度和初始pH为30℃和6.8，在7 L和100 L的生物反应器中酶产量分别达到150.3 U/mL和196.8 U/mL。对海洋真菌产纤维素酶的研究也较多，如青霉菌(Penicilliumsp.)[32]和酵母菌(A.pullulans)[33]。Chi的课题组最早报道产纤维素酶的海洋酵母菌A.pullulans98，其所产纤维素酶的最适作用温度和pH分别为40℃和5.6，最大酶活为4.51 U/mg，酶基因克隆表明其含1 497 bp的开放阅读框[33]。

1.5 褐藻酸裂解酶(alginate-lyase)

褐藻酸是一种酸性多糖，主要存在于海洋褐藻如海带、马尾藻和巨藻等的细胞壁中。褐藻酸裂解酶是催化褐藻酸降解的一类酶，通过β-消除机制裂解褐藻酸单体之间的β-1,4糖苷键，从而将褐藻酸降解成一系列长短不一的寡聚物或单糖。按照降解底物的不同，褐藻胶裂解酶可分为3大类：古罗糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.11)、甘露糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.3)和两者都可裂解的双功能酶。褐藻酸裂解酶主要用于制备褐藻胶寡糖和褐藻原生质体。褐藻胶裂解酶来源广，包括土壤微生物、海藻、海洋软体动物和海洋微生物等，其中海洋细菌来源的酶种类最多。

产褐藻胶裂解酶的海洋细菌包括弧菌(Vibrio)、交替单胞菌(Alteromonas)、假单胞菌(Pseudomonas)、黄杆菌(Flavobacterium)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)等[34]。大多数细菌产褐藻胶裂解酶为诱导型，即只在含有褐藻胶的培养基中才能检测到酶活性，少数几种细菌如假单胞菌(P.alginovora)能组成型产生褐藻胶裂解酶[35]。海洋细菌褐藻酸裂解酶的最适pH在7.5～8.5之间，最适温度为25～50℃。弧菌VibrioalginolyticATCC17749经色谱分离获得的褐藻胶裂解酶为甘露糖醛酸裂解酶，而弧菌V.harveyiAL-128的酶为古罗糖醛酸裂解酶，两者的分子量分别为47 kDa和57 kDa，等电点分别为4.6和4.3[36]。假交替单胞菌P.citreaKMM 3297可以产生两种胞内褐藻胶裂解酶，分子量分别为25 kDa和79 kDa[37]。

2 脂类水解酶(lipolytic enzyme)

脂类水解酶指能够催化酯类化合物的水解和合成的一类酶，根据催化底物链的长短可以分为酯酶(esterase，EC 3.1.1.1)和脂肪酶(lipase，EC 3.1.1.3)。酯酶水解或者合成酰基碳链长度小于10的甘油酯类，脂肪酶催化水解酰基碳链长度大于10的甘油酯类。脂类水解酶底物谱广，催化反应不需要辅酶和辅因子，在有机溶液中稳定性高，这些特点使其成为工业生产中的重要催化剂，广泛应用于医药行业、食品加工、纺织洗涤和废水处理等方面。

脂类水解酶广泛存在于动物、植物和微生物中，微生物脂肪酶的商业化生产主要是通过Rhizopusdelemar、Aspergillusniger、Geotrichumcandidum、Candidarugosa和Chromabacteriumviscosum等真菌、酵母和细菌的发酵获得[38]。Feller等[39]从南极海水中筛选到能够产生脂肪酶的细菌MoraxellaTA144，并实现了其3个脂肪酶基因在E.coli中的克隆表达。Jiang等[40]对海洋细菌PelagibacteriumhalotoleransB2T的酯酶PE10进行了基因克隆和表达，重组蛋白的分子量为29.91 kDa，最适温度和pH分别为45℃和7.5，最适底物为对硝基苯酚乙酸酯。郝文惠等[41]从南极深海沉积物样品中分离筛选到3株产脂肪酶的细菌Pseudoalteromonasarctica、Bacilluspumilus、Glaciecolasp.，1株产脂肪酶的真菌Leucosporidiumsp.。B.pumilus所产脂肪酶为低温脂肪酶，最适反应温度为30℃，其他3种菌所产脂肪酶为中温酶。

3 蛋白酶(protease)

蛋白酶是能水解蛋白质或多肽肽键的一类酶，广泛存在于动物、植物和微生物中，是最早应用于工业生产的酶。蛋白酶也是用途最广泛的酶制剂之一，利用不同生物所产蛋白酶种类和性质上的差异，已经开发出多种蛋白酶产品，分别在食品、医药、洗涤剂和纺织等行业得到了广泛使用。近年来蛋白酶在防污领域的研究也取得了很多进展，成为新型环保防污添加剂研究的关键领域。

产蛋白酶的微生物种类很多，主要包括细菌(如枯草芽孢杆菌、假单胞菌)、霉菌(如黄曲霉、米曲霉)和放线菌(如链霉菌)等。海洋微生物蛋白酶研究较多的是细菌和酵母菌。Chi等[42]从海水和海泥中分离到327株海洋酵母，其中12株具有蛋白酶活性，并对1株普鲁兰类酵母A.pullulans10产碱性蛋白酶的发酵条件进行了优化。Zhang的课题组发现从日本南部冲绳海槽1 245 m的海底沉积物中分离的菌株MyroidesprofundiD25能够分泌新型弹性蛋白酶myroilysin和胶原蛋白酶myroicolsin，并对两种酶进行了分离纯化、酶学性质和功能等研究[43,44]。Sunog等[45]从海洋假交替单胞菌Pseudoalteromonassp.A28的发酵产物中分离到一种蛋白酶，这种蛋白酶具有杀灭骨条藻SkeletonemacostatumNIES-324的活性。

4 漆酶(laccase)

漆酶(EC 1.10.3.2)是一种含铜的多酸氧化酶，最早于漆树的树液中发现，多种生物包括植物、真菌、细菌和放线菌等可以产生漆酶。目前发现的产漆酶海洋微生物主要是真菌。Bonugli-Santos等[46]发现了3株海洋真菌A.sclerotiorumCBMAI 849、CladosporiumcladosporioidesCBMAI 857和Mucorracemosus847能够利用麸皮产生漆酶。D’Souza-Ticlo等[47]发现分离自红树林的担子菌NIOCC #2a(MTCC 5159)可以产生漆酶，并发现其在0℃时酶活最高，Na2+、Al3+、Mg2+和Ba2+等金属离子对其酶活基本无影响。Dela Cruz等[48]研究了小树状霉菌Dendryphiellaarenaria和D.salina对96种碳源的利用情况，发现两种菌均可利用70种左右的底物生产漆酶。

5 其他酶

5.1 几丁质酶

几丁质及其衍生物在医药、食品、工业等方面的重要作用使得几丁质酶的研究得到关注。几丁质酶(chitinase，EC 3.2.1.14)的分子量多在6万～8万之间，最适反应pH为5.5～8.0，最适温度介于40～60℃。Svitil等[49]发现V.harveyi能够利用不同的几丁质底物产生几丁质酶，并进行了酶基因克隆。Osawa等[50]利用几丁质作为唯一碳源，得到了6种可以产生几丁质酶或几丁质二糖酶的海洋细菌V.fluvialis、V.parahaemolyticus、V.alginolyticsus、Listonellaanguillarum及Aeromonashydrophila。另外，海洋细菌Alteromnas、Pseudomonas和Clostridium等和海洋放线菌Streptomyces也有产几丁质酶的报道。

5.2 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)

碱性磷酸酶(EC 3.1.3.1)是一种磷酸酯水解酶，可以催化所有磷酸酯的水解反应和磷酸基团的转移反应，在水生态系统的磷循环中发挥重要作用。海洋微生物是碱性磷酸酶的重要来源，Sobecky等[51]利用碱性磷酸酶的工程菌研究了其对海洋环境磷循环的重要影响。

5.3 溶菌酶(lysozyme)

溶菌酶(EC3.2.1.17)是一类专门作用于微生物细胞壁肽聚糖的水解酶，广泛存在于动物、植物和微生物中。海洋溶菌酶与其他溶菌酶在性质及抑菌谱等方面有所不同，相比之下，海洋溶菌酶的最适作用温度偏低，热、酸和碱稳定性好，抑菌谱较广，对大部分革兰氏阳性菌和阴性菌都起作用，对白色念珠菌和黑曲霉等也有作用。王跃军等[52]对一株海洋杆菌低温溶菌酶的分离纯化及理化性质进行了研究，该溶菌酶的分子量为16 kDa，等电点为9.28，对溶壁小球菌的最适作用pH为6.5，最适作用温度为35℃。

6 展望

海洋是巨大的生命宝库，蕴藏着丰富的微生物资源，但是相对于陆地，海洋微生物的研究还较少。近二十多年来，国内外对海洋微生物的研究发展很快，筛选了大量海洋微生物，分离纯化了多种生物酶并且进行了分子生物学研究。21世纪是海洋的世纪，海洋微生物酶制剂将在食品、环境和化工等领域展现广阔的应用前景。

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Advances on Enzymes from Marine Microorganisms

SHI Cui-juan,YAN Pei-sheng*,ZHAO Rui-xi,HAN Xiao

SchoolofMarineScienceandTechnology,HarbinInstituteofTechnologyatWeihai,ShandongWeihai264209,China

The microorganism is rich in ocean,and marine microorganism is becoming the important source of enzyme.Many species of marine bacteria,actinomycetes and fungi can produce enzyme with activity.The polysaccharase,lipolytic enzyme,protease,laccase and other enzymes from marine microorganisms were summarized,which was expected to provide reference for utilization study of marine microorganism.

marine microorganism; polysaccharase; lipolytic enzyme; protease; laccase

2015-04-08; 接受日期：2015-04-24

中国大洋协会国际海域资源调查与开发“十二五”重大项目(DY125-15-R-01);哈尔滨工业大学优秀团队支持计划资助。

史翠娟，高级工程师，博士，主要从事海洋微生物资源开发与利用研究。E-mail: shicjwh@126.com。*通信作者：闫培生，教授，博士生导师，研究方向为海洋微生物资源与利用、海洋生物质及其加工废物的高值资源化、有害微生物的生物防治与生物农药、微生物发酵工程与生物制药等。E-mail: yps6@163.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.03.06