分子标记在地下啮齿类动物扩散中的应用

刘 丽，纪维红，花立民，楚 彬，周延山

(甘肃农业大学草业学院 甘肃农业大学—新西兰梅西大学草地生物多样性研究中心，甘肃兰州730070)

扩散(Dispersal)是物种在其生活史特定阶段多个时间和空间尺度上所表现出的生态学过程及特征。其对个体的存活、繁殖、生长、栖息地的选择，以及种群组成、动态和遗传结构等都均有重要的影响［1］。扩散是一种高度可变的现象，其扩散距离、扩散频率、扩散时期和扩散性别因动物个体差异而表现各异［2］。扩散也是一个种群能够长期生存的关键，是一种源于种群个体行为特征的综合现象［3-4］。目前，动物扩散已成为动物生态学研究的核心问题之一。其目的是通过研究个体扩散的时间和空间尺度，揭示物种在不同栖息地间选择和利用的规律［5-6］。

地下啮齿动物是一类高度适应地下生活方式的穴居动物，主要依靠广泛挖掘地下通道来获取所需的食物，选择栖息地并完成扩散行为［7］。地下啮齿动物的扩散既是基因交流和维持种群稳定的过程，也是造成环境危害的重要行为之一。如我国高寒草原的主要地下鼠——高原鼢鼠(Eospalax baileyi)，其对草原的危害面积不断扩大就是与扩散密切相关。因此，了解更多有关扩散对其种群动态和遗传方式的影响［8-9］，对认识地下啮齿动物在生态系统中的作用具有重要意义［10-11］。

地下啮齿动物由于栖息于地下，难以直接观察，增加了对其种群扩散研究的困难。随着分子生物学技术的不断发展，如微卫星DNA(Microsatellite DNA)、DNA指纹技术(DNA fingerprinting)、线粒体DNA(Mitochondrial DNA)等技术的完善和应用，人们对动物生态学，包括种群遗传分化，种群间的扩散特点和关系，以及生殖策略等众多问题获得了更深入的认识。目前，国内外已将分子生物学技术应用到地下啮齿类动物的扩散研究中，对研究种群间的基因流水平、偏性扩散现象以及扩散的影响因素提供了技术支撑和理论依据，使在更大时间尺度和空间尺度上研究扩散成为了现实［12-13］，也为地下啮齿动物危害的治理提供了一定的生态学研究的理论依据［14］。

1 微卫星标记在地下啮齿类动物扩散中的应用

微卫星标记(Microsatellites)也称简单序列重复(Simple Sequence Repeat，SSR)或短串联重复(Short Tandem Repeat，STR)，是指以1 ～6 个核苷酸为重复单位组成的简单串联重复序列，重复次数的不同和重复程度的不一致造成了这些序列的多态性。微卫星作为近年来发展迅速、应用广泛的分子标记，具有多态性高、保守性好、呈共显性遗传及符合孟德尔遗传规律等优点，在群体遗传、遗传连锁图谱构建、亲缘关系划分及种质结构分析等领域发挥着巨大的作用，并在自然种群的许多研究方面得到了广泛的应用［15-19］。

目前，分子标记技术已从过去的小卫星技术发展到微卫星技术，并在地下啮齿类动物的一些种群扩散研究中不断应用［20-23］。微卫星标记在行为学上的应用以及现代遗传数据分析方法，为研究难以直接观察的动物类群的扩散机制及影响动物扩散的因素提供了先进的研究手段［24-26］。如Cutrera 和Fernández-Stolz 等利用微卫星位点分析研究栉鼠科扩散时，发现栉鼠种群具有某些扩散特点，如该物种的扩散主要偏雄性［27-28］。Mora 等［9］在此基础上，利用微卫星标记和贝叶斯分析方法(Bayesian Analysis)揭示了南栉鼠(Ctenomys australis)的种群结构以及在不同空间尺度上种群的扩散模式，发现在试验区域的部分地区存在偏雄性扩散现象，在连续存在栖息地的情况下雄性比雌性的扩散距离更远，而且雄性个体扩散更加频繁。但并不表明雌性个体是因为对聚居地有强烈的归属感而不扩散。但是在南栉鼠扩散的研究中，其已经开发的微卫星位点多态性低于同一属中其他物种［27-28］，所以在小尺度范围内(＜4 km)很难发现偏性扩散，也就是说南栉鼠的偏性扩散不仅仅局限于某一空间尺度内［9］。在其他地理尺度范围，Mapelli 等［29］用微卫星标记来分析濒临灭绝的啮齿动物包氏栉鼠(C. porteousi)的种群结构和基因流模式，并用景观遗传学方法分析景观配置对种群之间基因交流的影响，发现在小的空间尺度下包氏栉鼠有稳定的遗传结构，生境破碎化能增强种群分化。除南栉鼠外，Patzenhauerová 等［30］利用微卫星标记研究非洲滨鼠科种群的亲属关系结构和交配体制，发现不同种群间个体的扩散在一定程度上影响种群的雌雄比例，继而影响种群的交配系统和基因结构，体现了扩散的重要性和意义。但是对种群的扩散特点和扩散行为并没有进一步的研究。

2 DNA 指纹技术在地下啮齿类扩散中的应用

DNA 指纹基于生物DNA 序列多态性。这种多态性是同种的不同个体间出现很小概率的碱基对改变，而这种不同种本身一致序列的改变存在于部分个体中。单个个体是拥有整个改变集合中的一个小集合部分，从而有种群个体DNA 的核苷酸种类、数量、排序的变化，部分导致酶切位点等的改变，酶切后呈现限制性片断长度多态性(RFLPS)。而相对于RFLPS 来说，DNA 指纹分析主要是以小卫星或微卫星位点的变化为基础［31］。由于DNA 指纹图谱在动物和人类中一样，具有个体高度特异性、体细胞稳定性和种类稳定性等的特点，而且这种特异性仍遵循简单的孟德尔遗传规律，因此成为具有吸引力的遗传标记方式之一，具有广泛的用途［32-33］。

Reeve 等［10］和McLeish 等［11］利用DNA 指纹技术研究其4 个不同聚居地之间裸鼢鼠(Heterocephalus glaber)种群的亲缘关系，试验结果发现，其亲缘系数是在有记载的野生哺乳动物中最高的，聚居地内个体DNA 指纹的相似性体现了裸鼢鼠种群较近的亲缘关系，存在高水平的近亲繁殖，同时也说明了生态条件对种群扩散有约束作用。Zenuto 等［34］利用DNA 指纹图谱在栉鼠的两个不同种群中研究其交配特征时得出，栉鼠种群中存在一雄多雌的交配现象，在不同的种群中进行扩散的个体类型不同，在Zenuto 等［34］的研究中，应用分子方法和物种个体的形态指标进行综合分析表明，种群扩散中亚成体的扩散最为常见［35］。但对栉鼠科的另一个种(C.flamarioni)研究发现，出生地的小尺度范围内也有幼体在扩散［28］。

3 线粒体基因在地下啮齿类动物扩散中的应用

3.1 线粒体细胞色素b 基因

线粒体基因研究主要分为线粒体细胞色素b 基因和线粒体DNA 研究两类。细胞色素b(Cytochrome b，cyt-b)基因也是线粒体中结构和功能被了解得较为透彻的基因，进化速度适中，因而将其作为分子系统学研究的分子标记［36］。哺乳动物中的线粒体cyt-b 是构成线粒体氧化磷酸化系统复合体Ⅲ的蛋白质之一［37］。线粒体细胞色素b 基因有以下几个特点:1)是蛋白质编码基因，而且比线粒体rDNA 和非编码区更易于排序;2)在一定的进化尺度内该基因不受饱和效应的影响，所提供的系统发育信息和遗传分化水平适用于物种种间或属间差异的分析;3)与大多分子系统相比较，细胞色素b 基因蛋白质产物的生化机理易与其基因的进化动力学相联系［38］。因此，在系统发育中cyt-b 是一个十分有效的标记，并得到广泛的应用［39-41］。

Tang 等［42］在青藏高原相距27 ～600 km 的12个高原鼢鼠群体中分别采样，分析线粒体细胞色素b 基因序列，发现高原鼢鼠种群中发生了变异且部分母系基因流受到地理区域条件的限制，证明限制性基因流成为各地理种群分化的主要原因，进化分析和类聚分析都表明该种群的种群结构和系统发育是不连续的。此外根据线粒体细胞色素b 和D-loop区直接测序的序列数据，运用种群遗传学和分子系统地理学方法，分析187 只高原鼢鼠在DNA 水平上的遗传多样性、系统地理结构及种群历史动态，结果发现，显著性的多态性变异比例主要分布在群体间(76. 3% ～88. 7%)和 群 内 种 群 间(8. 2% ～20.7%)，说明高原鼢鼠存在显著的系统地理结构与遗传分化水平。而在不同的地域性分支间双向基因流水平很低(0.03 ～0.12)，表现为各分支间平均每一百代有3 ～12 只高原鼢鼠的交换，可能这种限制性的基因流与高原鼢鼠特有的地下挖掘取食行为有关。而不同地域性分支的分歧时间正好是第四纪冰期的频发期。物种内在生物学特性决定的限制性基因流与外在冰期产生的距离隔离、生境斑块化，是造成高原鼢鼠地域性种群分化及现有系统地理格局的主要原因［43］。在第四纪地壳运动和冰川作用后，高原鼢鼠的地理分布区不断提高，而随后其种群没有往低海拔处迁移或扩散［44］。

国外有利用线粒体细胞色素b 和rRNA 序列相结合的方法来研究种群在空间大尺度范围的扩散情况。Van Daele 等［45］和Brown 等［46］在非洲滨鼠科的系统地理学的动态研究中，通过对滨鼠科线粒体12S rRNA 和细胞色素b 的序列分析，提出了在整个种群的扩散过程中河流、裂谷、火山等对其扩散的阻碍作用，以及影响种群扩散的因素［45-46］。栖息地之间的自然隔离对种群扩散有阻碍作用，而栖息地自身地形特点对种群扩散和生存有无影响?为了验证在孤立或半孤立栖息地聚居的栉鼠(C. lami)种群受到灭绝的风险会更大，Lopes 和De Freitas［47］利用线粒体DNA(D-loop)、微卫星标记技术进行了研究，结果在试验范围内两个同类群体内得到了证实，生活在此类栖息地的种群其遗传结构比较脆弱，种群栖息地特点(孤立或半孤立栖息地)对个体扩散和生存的影响较大。

3.2 线粒体D-loop 序列

线粒体DNA 具有分子量小、结构简单、无重组、母系遗传、一级结构进化速度快等特点，它是亲缘关系较近的物种间和种内居群间遗传多样性、遗传分化、起源进化研究等的适宜遗传标记，其中控制区(D-loop)为非编码区，因缺乏编码的选择压力而比其他基因的进化速率更快［48］，且有最大的变异速率，突变固定后所形成的多态位点可以反映出群体的遗传特征、种群分化以及种属关系等，作为种群遗传研究中的理想标记基因而被广泛应用［49-52］。

利用线粒体DNA 部分序列［序列长624 ～626 bp，包括控制区3'端序列(530 bp)、tRNAphe(67 bp)、部分12S rRNA 5'端序列(29 bp)］对高原鼢鼠种群进行距离隔离研究，发现高原鼢鼠的遗传分化与地理距离呈极显著正相关(P ＜0.01)，同时研究表明，当地理距离超过100 km 时，遗传距离趋于稳定。因此，在不排除地理屏障的情况下，高原鼢鼠种群间地理隔离距离为100 km 左右［53-54］。通过分析线粒体DNA(D-loop)和ND4 基因测序得出，在高原鼢鼠中有较大的序列变异和单倍型多样性，种群间比种群内有更大的遗传距离［55］。

在用线粒体D-loop 序列研究南栉鼠的地理遗传结构时发现，种群遗传分化并不符合简单的距离隔离模型，基因流和当地遗传漂变间可能缺乏平衡。对这种分布不匹配的情况分析得知，基因谱系的星型拓扑结构模式与种群近期的扩张活动相符合，但是不能排除另一种基于偏离严格中立线粒体DNA 的解释［56］。此外，在分析南栉鼠种群的地理亲缘关系和群体遗传结构时发现，种群间的地理距离是造成种群遗传分化的主要原因［57］。利用线粒体DNA 母性遗传确定了裸鼢鼠属(Heterocephalus)和平齿囊鼠属(Thomomys)两个种群内杂交的偏母性遗传现象［58-59］，这体现了线粒体基因的遗传特点。

4 小结

目前，微卫星技术、DNA 指纹技术、线粒体基因这3 种不同的分子标记技术在地下啮齿类研究中都有应用，但各具特点(表1)。

利用CNKI 和Google 等搜索引擎，对1980—2014 年利用分子标记方法研究不同地下啮齿类动物扩散的相关文章数量进行了统计(图1)，结果显示，利用分子生物学技术在栉鼠科动物方面的研究较多，主要集中在栖息地选择、偏性扩散等方面。具体到啮齿类动物，利用分子生物技术研究高原鼢鼠的文章相对较少，而且主要集中在系统进化方面。因此，借鉴有关栉鼠科动物扩散方面的研究，利用分子生物学技术开展对高原鼢鼠的扩散研究是对啮齿类动物研究有力的补充。

表1 不同分子标记技术主要特点Table 1 The main features of different molecular marker technology

图1 不同地下啮齿类相关文章数量Fig.1 The related papers of different subterranean rodent species

对不同年代，利用分子生物学方法研究地下啮齿类动物扩散的相关文章数量进行了统计(图2)。结果发现，在2000 -2010 年的10 年间，相比20 世纪90 年代发表的文章要多。从2010 -2014 年，尽管只有4 年，但是在这方面发表文章的势头很好，也体现出了分子生物学技术在此领域的应用不断地增加。

图2 不同年限地下啮齿类相关文章数量Fig.2 The related papers of subterranean rodent species in different stages

尽管，地下栖息啮齿动物独特的生活习性增加了扩散研究的难度。但是，个体标记研究缺乏大范围和大尺度的代表性，运用分子标记技术可以解决这些问题。但是所有的技术不一定都是完美的。不同的分子标记方法也有一定的缺陷，在研究种群扩散规模和扩散速度时其基因结构和数量统计是密切联系的［60］。在试验过程中选择可供分析的位点数量、分子标记的多态性水平都是影响试验的因素［61］。根据各种不同分子标记技术的特点，选择恰当可行的方法来研究动物的扩散机理。当然每一种分子标记都有其自身的特点，微卫星具有高度多态性，且分布均匀、含量高，但对于核苷酸数据库中没有的微卫星序列，其主要问题是位点的准确开发和侧旁序列的测定［62］，与其他两种分子标记相比较，对种群遗传结构的分析效果良好，所以也成为研究高原鼢鼠扩散机理的首选分子标记方法。在采用DNA 指纹技术确定种群个体间的关系时，需要结合其他生态学方面的因素来综合考虑，充分发挥DNA指纹技术的作用和优势［63］，用DNA 指纹技术研究种群遗传多样性操作过程较复杂。DNA 序列分析能充分地揭示DNA 多态性，线粒体DNA 在遗传上具有自主性、分子量小、母系遗传等优点，因而在分析种群的遗传变异、确定种内或种间的系统发生和进化等方面得到了广泛的应用。但是线粒体DNA序列分析也存在自身的缺陷，在种群学的研究中需要对多基因进行测序，时间长，费用高，相比较而言在种群遗传结构研究中较繁琐，因而其可行性不是很高［64］。

5 展望

地下啮齿类动物的扩散研究由于其地下栖息习性难于被观察而面临很多挑战。但是随着科学技术的发展，将分子生物学和其他生态学方法结合，已经应用到地下啮齿动物的研究中［9］。微卫星标记在行为学上的应用及现代遗传数据分析方法，为研究难以直接观察的动物类群的扩散机制及影响动物扩散的因素提供了先进的研究手段［24-26］。国外已经将微卫星标记的方法应用到扩散距离、扩散鼠种的亲缘关系等研究中［9，30］。随着分子标记技术的发展，试验成本不断降低，更多分析方法的使用将大大提高试验数据的可靠性。

高原鼢鼠是我国特有的地下啮齿动物之一，属于仓鼠科(Cricetidae)鼢鼠属，广泛分布于青藏高原东部海拔2 800 ～4 200 m 的地区，其种群活动受地上环境的影响较小。稳定的地下生活环境和有限的迁移能力造成该物种的变异性较小，进化潜力较弱，分布区域有限，从而也成为青藏高原的特有种之一［65］。作为小型地下哺乳类动物，对生态系统有着重要的意义。近年来，受人为因素和气候变化的影响，青藏高原部分地区高原鼢鼠种群密度上升，打破了原来处于动态的草“鼠”平衡，造成草原鼠害加剧，导致草地生产力下降［66-67］。目前，高原鼢鼠危害区域呈扩大和蔓延趋势，与高原鼢鼠的扩散行为密切相关。因此，研究高原鼢鼠种群扩散，发现高原鼢鼠的扩散机理，就有可能针对性地通过切断或保护其扩散通道达到控制草原鼠害或保护生物多样性的目的，对青藏高原生态保护有着重要的意义。目前，对高原鼢鼠种群扩散的研究不多，并不清楚高原鼢鼠种群的扩散机制，而利用分子标记的方法研究其扩散的报道就更少。本研究提到的3 种分子标记中，微卫星标记技术有独特的优越性和应用前景，也是研究高原鼢鼠种群扩散的首选方法。微卫星位点的开发和筛选是重点也是难点，目前已有开发了高原鼢鼠的微卫星位点并设计引物进行更进一步的研究［68］，在后期的试验中希望筛选出适合的引物并进行扩增，获得适用于该种群遗传多样性分析的位点，为试验深入进行奠定良好的基础。同时应结合无线电追踪技术，合理设计试验，研究高原鼢鼠的扩散机理、特点和偏性遗传现象，填补有关高原鼢鼠扩散方面研究的不足。

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