紫花苜蓿对镉胁迫的生理响应及积累特性

孙宁骁，宋桂龙

(北京林业大学草坪研究所，北京100083)

近些年来，随着我国城市化、工业化发展及农用化学品的过量使用，环境污染、生态破坏日益严重，影响到人类的生存和健康，其中重金属元素对环境的污染和破坏作用尤为严重［1］。Cd 是生物非必需的元素，对环境危害极大，它不仅会导致土壤正常的功能失调、质量下降，而且会对植物产生毒害作用［2］。紫花苜蓿(Medicago sativa)是豆科多年生牧草，其适应性强，虽然富集能力比不上很多超富集植物，但是由于生物量大、生长快，其富集总量甚至比超富集植物还要高［3］。到目前为止，Cd 对不同植物形态、生理等方面的影响已有大量研究［4-6］，但对紫花苜蓿在Cd 胁迫下生长发育的研究报道并不多。本研究分析紫花苜蓿对Cd 胁迫的反应及积累特性，探讨Cd 对紫花苜蓿的生理影响及紫花苜蓿在Cd 污染土壤修复中的应用潜力，旨在为紫花苜蓿在土壤修复中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料及试验地概况

紫花苜蓿(品种“新疆大叶苜蓿”)种子来源于北京林业大学草地资源实验室，供试土壤为草炭土与农田的表层土壤3∶ 1 混合。经实验室测定，土壤性质pH 为6.79，全氮含量为3.65 g·kg－1，有机质含量为127 g·kg－1，有效磷含量为20.9 mg·kg－1，有效钾含量为262 mg·kg－1，土壤阳离子交换量为350 mmol·kg－1。盆栽试验于北京林业大学气象站后生物学院所属温室旁的院内进行。

1.2 试验设计

试验采用完全随机区组设计，对紫花苜蓿设置6 个Cd 处理水平，3 个重复，共计18 盆，每盆5 株。6 个处理的Cd 添加量从低到高依次为T0(0)，T1(10 mg · kg－1)，T2(25 mg · kg－1)，T3(50 mg·kg－1)，T4(100 mg · kg－1)和 T5(200 mg·kg－1)。试验用塑料盆钵，直径23 cm，高20 cm，每盆装土4 kg。重金属Cd 以CdCl2·2.5H2O(分析纯试剂)形式，按不同处理水平加入土壤，并与土壤充分混合均匀，制成不同Cd 浓度的土壤，土壤稳定一周后播种。播种后86 d 采集植物样品测定生理指标，播种后106 d 收获植株，处理后进行植物干重和重金属Cd 含量的测定。

1.3 测定方法

1.3.1 相对电导率 相对电导率的测定在陈建勋［7］的方法上稍有改动。称取紫花苜蓿叶片0.1 g，剪成1 cm 的小段，置于试管中，加入25 mL 蒸馏水;用封口膜封口，室温下摇床振荡24 h，用电导仪测电导率EL1;再次封口，牙签扎孔通气，沸水浴30 min，温度降到室温时测电导率EL2;将不加叶片的蒸馏水进行振荡、沸水浴，将降到室温时的电导率作为对照，记为EL0。根据公式(1)计算相对电导率:

1.3.2 脯氨酸含量的测定 参考酸性茚三酮法测定［8］，在此基础上稍有改动。称取紫花苜蓿叶片0.1 g，3%磺基水杨酸浸提，2.5%酸性茚三酮显色，最后用2.5 mL 甲苯萃取，在520 nm 下使用721 型分光光度计比色测定。

1.3.3 叶片叶绿素含量的测定 根据张志良［9］的方法，稍有改动。称紫花苜蓿叶片0.05 ～0.08 g，记下具体质量，剪碎后置于离心管中;加入8 mL 95%的乙醇，室温下避光静置48 h;于665 nm、649 nm 测定其吸光值;用95%乙醇调空白。根据公式计算:

叶绿素a 含量=Ca·V/W;

叶绿素b 含量=Cb·V/W;

式中，Ca为叶绿素a 的浓度(mg·L－1);Cb为叶绿素b 的浓度(mg·L－1);A665和A649分别表示665 和649 nm 下的吸光值;V 为提取后的体积(L);W 为叶片鲜重(g)。

1.3.4 植物生物量的测定 收获植物，沿土面剪取地上部分，同时洗出根系，烘箱内105 ℃杀青15 min，并在80 ℃下烘至恒重，烘干后用天平称量植物各部分干重。

1.3.5 植物体内Cd 含量的测定 Cd 含量用电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-AES)测定。

转运系数=地上部植物中Cd 质量分数/地下部植物中Cd 质量分数［10］;

耐性指数=重金属处理条件下植物干重/对照组植物干重［11］;

积累量=植物地上或根系Cd 积累浓度×植物地上或根系生物量。

1.4 数据分析

运用SPSS 17.0 软件对所测数据统计分析，测定结果表示方法为平均值±标准误，对不同Cd 浓度处理下紫花苜蓿各指标进行单因素方差分析，并用Duncan 法对测定数据进行多重比较;制图采用Excel 2010。

2 结果与分析

2.1 不同Cd 浓度对紫花苜蓿生长影响

不同浓度Cd 胁迫下紫花苜蓿的生长状况如表1 所示，Cd 浓度达到200 mg·kg－1时，紫花苜蓿死亡。随着Cd 浓度的增加，紫花苜蓿株高呈现递减的趋势。当Cd 浓度在50 和100 mg·kg－1时，株高与对照差异显著(P ＜0.05)，降幅分别达到21.96%和30.65%;紫花苜蓿地上部和地下部干重随Cd 浓度增加基本呈现先增大后减小的趋势，Cd 浓度为25 mg·kg－1时，地上部干重达到最大，且与对照差异显著，地下部干重在10 mg·kg－1时达到最大，但与对照差异不显著(P ＞0.05)。

表1 紫花苜蓿的生长状况Table 1 Growth of Medicago sativa

2.2 不同Cd 浓度对紫花苜蓿生理影响

2.2.1 紫花苜蓿相对电导率 Cd 浓度达到200 mg·kg－1时，紫花苜蓿死亡。随Cd 浓度增加，叶片相对电导率呈现递增的趋势(图1)。Cd 浓度为10 mg·kg－1时，与对照差异不显著(P ＞0.05);Cd 浓度增加至25 和50 mg·kg－1时，叶片相对电导率比对照显著增加;当Cd 浓度达到100 mg·kg－1时，紫花苜蓿叶片相对电导率达到最大值，与其他处理差异显著，相比对照增幅达到30.02%。

2.2.2 紫花苜蓿脯氨酸含量 随Cd 浓度增加，叶片脯氨酸含量基本呈现先增大后减小的趋势(图2)。Cd 浓度达到25 mg·kg－1时，脯氨酸含量最高，与对照差异显著(P ＜0. 05)，相比对照增幅达到34.74%;Cd浓度超过25 mg·kg－1后，脯氨酸含量逐渐下降;Cd 浓度达到100 mg·kg－1时，脯氨酸含量最低，且与其他处理差异显著，与对照相比降幅到达33.60%。这表明，低浓度Cd 胁迫使紫花苜蓿体内积累脯氨酸，维持正常代谢，高浓度Cd 胁迫使细胞机能丧失，不能积累脯氨酸以提高紫花苜蓿对Cd的抗性。

图1 Cd 胁迫对紫花苜蓿电导率的影响Fig.1 Effects of Cd stress on relative conductivity

图2 Cd 胁迫对紫花苜蓿脯氨酸的影响Fig.2 Effects of Cd stress on proline content

2.2.3 紫花苜蓿叶绿素含量 随Cd 浓度增加，叶绿素a、b 及总量都呈现递减趋势(表2)。Cd 浓度为10 mg·kg－1时，叶绿素含量略有下降，但与对照差异不显著(P ＞0. 05);Cd 浓度为25 和50 mg·kg－1时，叶绿素a 和总量与对照差异显著;Cd浓度为100 mg·kg－1时，叶绿素含量最低，与对照相比下降32.55%，且与其他处理差异显著;叶绿素a/b 值随Cd 浓度增加逐渐下降，但各个处理之间差异不显著。这表明，Cd 胁迫对紫花苜蓿细胞膜造成损害，导致叶绿素合成受到影响，从而使叶绿素含量急剧降低，最终将导致光合作用的下降。

2.3 不同Cd 浓度紫花苜蓿积累特性

Cd 的积累浓度随Cd 浓度增加而增加，且地下部Cd 积累浓度均大于地上部;Cd 浓度为10 mg·kg－1时转运系数最高，但与25 和50 mg·kg－1差异不显著(P ＞0.05);Cd 浓度为25 mg·kg－1时耐性指数最高，与其他处理差异显著;Cd 浓度为25 mg·kg－1紫花苜蓿地上部积累量最大，与对照间差异显著(P ＜0.05);Cd 浓度为100 mg·kg－1地下部积累量最大，与各处理之间差异显著(表3)。

表2 Cd 胁迫对紫花苜蓿叶绿素的影响Table 2 Effects of Cd stress on chlorophyll content

表3 Cd 在紫花苜蓿体内积累和分布Table 3 Cd concentration and distributing in Medicago sativa

3 讨论与结论

Cd 是非营养元素，对植物有毒害作用，影响植物细胞代谢、生长发育并改变植物体的形态结构等［12-13］。在逆境条件下，当植物质膜受损后，细胞会启动响应机制，具体表现为电解质和某些小分子有机物大量渗漏［14］、渗透调节物质增加(如脯氨酸)［15］以及叶绿素含量降低［16］等情况。

本研究结果表明，代表质膜透性的相对电导率在Cd 胁迫条件下都出现显著(P ＜0.05)增加的情况，这与相关研究［2］的结果相同。脯氨酸可以降低膜脂过氧化程度［17］，本研究中紫花苜蓿处于低浓度Cd 胁迫条件下，脯氨酸含量的增加可能增强紫花苜蓿的抗性，但当Cd 处理浓度过高时，紫花苜蓿细胞机能萎缩，甚至死亡，导致脯氨酸含量下降。本研究中紫花苜蓿叶绿素含量随Cd 浓度增加而降低，这与相关研究结果相同［18-19］。叶绿素a/b值可作为叶片衰老的指标［20］，而试验紫花苜蓿叶绿素a/b 值均随Cd 浓度的增加而降低，说明高浓度的Cd 胁迫促进了紫花苜蓿叶片的衰老。

在实际修复中，紫花苜蓿对Cd 的去除效率主要取决于植株富集Cd 总量，即生物量与含Cd 浓度的乘积。因此，生物量与含Cd 浓度是两项非常关键的指标。试验中，低浓度Cd 胁迫可以增加紫花苜蓿地上部和地下部干重，这可能是由于紫花苜蓿体内某些激素抵消了Cd 胁迫，促进了植物生长。从地上部积累量来看，Cd 浓度为25 mg·kg－1时紫花苜蓿积累量最大，每盆为42.5 μg，若紫花苜蓿干草产量以10 000 kg·hm－2计［21］，每公顷紫花苜蓿地上部可以富集85 g Cd，加以地下部富集量，在土壤Cd 浓度为25 mg·kg－1时，紫花苜蓿总共可带走超过100 g Cd。在实际土壤修复中，若加以刈割、外施激素等农艺措施，可能会进一步提高紫花苜蓿对Cd 污染土壤的修复效率。

综上所述，Cd 胁迫引起紫花苜蓿叶片相对电导率增大，叶绿素含量降低，使叶片受到伤害;低浓度Cd 胁迫使紫花苜蓿叶片脯氨酸含量增加，促进了紫花苜蓿的生长，提高了紫花苜蓿在Cd 胁迫下的耐性指数，增加了地上部Cd 的积累量。由此可知，Cd浓度在25 mg·kg－1以下时，紫花苜蓿的生理状况良好，在实际土壤修复中有应用意义。

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