乳制品中异种蛋白掺假检测的研究进展

金萍，丁洪流，陈英，李培

（苏州市产品质量监督检验所，江苏苏州215128）

乳制品中异种蛋白掺假检测的研究进展

金萍，丁洪流，陈英，李培

（苏州市产品质量监督检验所，江苏苏州215128）

乳品掺假已成为困扰我国乳品工业发展的一个突出问题，本文阐述了乳制品中异种蛋白质摻假的常见手段，并综述了目前针对各种摻假手段的检测方法，如红外光谱法、高效液相色谱法、电泳法、比色法以及PCR方法等。

乳制品；摻假；检测

各种各样的乳及乳制品（如牛奶、酸奶、奶酪以及目前广受欢迎的羊奶粉）因其丰富的营养、美味的口感而广受大众的欢迎，然而一些不良商贩在非法利润的驱使下和越来越先进的检测技术的追迫下，不断改变和提高摻假手段，乳品掺假已成为困扰我国乳品工业发展的一个突出问题。乳品的蛋白质含量往往被用来评判质量的最重要的依据，因此乳品蛋白质摻假层出不穷，乳品蛋白质掺假不仅可以给众多消费者造成不可逆转的伤害，亦可重创中国制造商品信誉。

蛋白质掺假物根据性质不同可以分为假蛋白摻假物以及真蛋白掺假物，假蛋白掺假物其本质是一些非蛋白含氮物，如三聚氰胺。真蛋白掺假物根据来源还可分为植物源性蛋白掺假物（如大豆蛋白）以及动物源性蛋白掺假物。乳品中假蛋白掺假物的检测方法已经趋于成熟，形成规范的标准［1-3］，假蛋白掺假物的掺入已不能为掺假者赚取非法利润，反而有被查处的风险，这使掺假者去寻找新的掺假物来取代假蛋白掺假物，廉价的外源真蛋白必将会成为首选的掺假物，主要的掺入物有皮革水解蛋白、大豆蛋白、植物水解蛋白以及在高价的羊乳中添加牛乳等，真蛋白掺假物其本质是真蛋白，检测难度大。本文综述各类乳制品中真蛋白掺假检测方法的最新研究进展，旨在为后续的真蛋白掺假检测方法研究提供参考。

1乳及乳制品中植物源性蛋白掺假物的检测

目前最常掺入的植物源性蛋白有掺豆浆（大豆蛋白粉）、植物水解蛋白等，相较于牛羊乳比较廉价，但其这种行为一方面损害了消费者的权益，另一方面也是一种食品安全隐患，掺假乳标签上并不会注明，这容易使得一些大豆蛋白过敏者误食而引起不良后果，如呕吐、腹痛、腹泻，甚至过敏性休克。

1.1通过检测皂角素鉴别是否掺豆浆［4］

掺入豆浆的同时也引入了大豆中特有的皂角素。皂角素能溶于热水或热酒精，并与NaOH作用生成黄色，若有黄色出现则证明掺有豆浆。此方法简单快速，可以用于原料乳收奶现场的掺假检测。

1.2电泳法检测乳及乳制品中掺加的大豆蛋白

大豆蛋白和乳蛋白分子间带电性以及量存在区别，张东送［5］等根据蛋白分子带电性的差异利用毛细管电泳技术进行奶粉中大豆蛋白掺假的应用研究，实验结果表明，添加大豆蛋白的奶粉图谱上出现新的特征峰，而且大豆蛋白特征峰面积与添加量成正比。

吴茹怡［6］则根据大豆蛋白和乳蛋白分子量的区别，利用SDS-PAGE方法来检测牛奶中的豆奶成分。将牛奶和豆奶分别进行SDS-PAGE分析，SDS-PAGE电泳谱图上可看到7条牛奶蛋白带和13条豆奶蛋白带，牛奶中掺杂的豆奶体积分数为5%时即可被检测到。

1.3近红外光谱检测乳制品中掺加的水解植物蛋白

王右军［7］等研究利用近红外光谱快速定量检测牛奶中掺假物质的可行性，采用偏最小二乘法建立近红外光谱与牛奶中掺假物质含量之间的定量模型。结果表明对掺入的水解植物蛋白粉的定量预测准确度较高，相关系数为0.969，预测标准差为0.456 g/kg，可以满足定量检测的需要。

1.4PCR方法检测乳制品中植物成分

覃芳芳［8］等建立了应用PCR技术鉴别牛奶饮料中植物成分的方法，方法设计合成了针对线粒体tRNA Leu基因的引物，扩增牛奶中的植物成分，该方法可检测到牛奶中掺入的植物成分低至0.1%。模拟样品检测显示该方法准确性高，实际应用能力强。

2乳及乳制品中动物源性蛋白掺假物的检测

2.1乳及乳制品中掺入皮革水解蛋白粉的检测方法

“三聚氰胺奶”事件后，农业部于2009年开始在全国范围内进行生鲜乳质量安全监测工作。在三聚氰胺成为严打的对象后，一些不法企业和奶站便将目光锁定在“皮革水解蛋白”。2009年2月初，我国食品安全综合协调与卫生监督局所印发的《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第二批）》公布后仅一个月左右，浙江金华市晨园乳业被查出仍顶风作案，生产“皮革奶”，因此而被查封。那之后，皮革水解蛋白也被列入了生鲜乳制品的检测项目中。

皮革水解蛋白粉就是利用皮革下脚料甚至动物毛发等物质（类似于又粘又稠半透明状液体），经水解而生成的一种粉状物。因其氨基酸、明胶或者说蛋白含量较高，故人们称之为“皮革水解蛋白粉”。

皮革奶，就是通过添加皮革水解蛋白从而提高牛奶含氮量，达到提高其蛋白质含量检测指标的牛奶。由于这种皮革水解蛋白中含有严重超标的重金属等有害物质，致使牛奶有毒有害，严重危害消费者的身体健康甚至生命安全。

2.1.1比色法检测乳制品中掺加的水解胶原蛋白

皮革水解蛋白属于胶原蛋白，含有胶原蛋白所特有的氨基酸-羟脯氨酸（hydroxyproline，Hyp），Hyp在正常胶原蛋白中含量约为13.4%，而在其他蛋白质中则不存在［1］。李景红等［2-3］用比色法对乳制品中的羟脯氨酸进行检测，研究表明掺加量在1%以上就可以检测得到。具体方法：1）先将样品进行酸化，水解胶原蛋白，游离羟脯氨酸；2）再用氯胺-T氧化羟脯氨酸生成含吡咯环的物质，加入对-二甲基氨基苯甲醛溶液显色；3）558 nm波长处测吸光度，用标准曲线算得羟脯氨酸的质量浓度，由测得的羟脯氨酸换算得出乳中掺加的动物胶原水解蛋白的量。此方法所用仪器操作简便、经济，且操作方法步骤简单，检出限为9.00 μg/mL。

2.1.2色谱法检测乳制品中掺加的水解胶原蛋白

李景红等采用阴离子交换色谱-积分脉冲安培法［3］以及2，4-二硝基氟苯柱前衍生反相高效液相法［3，9］检测牛乳中的羟脯氨酸，由测得的羟脯氨酸含量推算得到牛乳中掺加的胶原水解蛋白量。阴离子交换色谱-积分脉冲安培法无需衍生处理，可直接对羟脯氨酸进行测定，检出限为1.0 μg/mL。高效液相法最低检出限为2.5 μg/mL。

水解动物蛋白不同于乳酪蛋白，不同的蛋白质分子具有不同的氨基酸组成比例，刘婷［10］等利用蛋白质的氨基酸组成差异性检测牛奶中掺入的水解蛋白，利用高效液相离子交换色谱法对乳粉和水解动物蛋白中的17种氨基酸进行分离测定以及筛选比较，发现其中6种氨基酸的含量差别较大：甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、赖氨酸和亮氨酸。掺入水解动物蛋白的乳粉其前3种氨基酸含量比例升高，后3种氨基酸含量比例下降。依据此6种氨基酸建立乳粉中水解动物蛋白的模拟检测，将实际检测中的数据与模拟检测数据进行对照半定量地检测出样品中水解动物蛋白的添加比例范围。

2.1.3氨基酸自动分析仪检测乳制品中掺加的水解胶原蛋白

曾暖茜等［11］利用日立835-50型氨基酸自动分析仪对氨基酸直接进行分析，羟脯氨酸与茚三酮反应后生成黄色产物，在仪器的第二通道波长440 nm有最大吸收，且保留时间不与其他氨基酸重迭，因此可用于测定乳制品中羟脯氨酸含量，氨基酸自动分析仪操作简单，自动化程度高，但要求具有相关的仪器。

2.2乳制品物种判别检测方法

奶食品除了牛奶，还有马奶、羊奶等。在欧美国家羊奶被视为乳品中精品，称作“贵族奶”。国际学界誉为“奶中之王”。羊奶与牛奶的主要组成相近，而某些营养素比牛奶高出很多。含有牛奶不具备的一些特殊物质，如：EGF表皮生长因子，免疫球蛋白。不含牛奶引起的过敏物质α-S1的酪蛋白。国际乳品联合会原中国专家委员会委员金世琳在《金世琳乳品科技文选》中说过：“如今，在美国山羊奶被放在药房和超级市场销售……从全世界范围来看，山羊乳在全部乳类中有迅速发展的趋势［12］。

山羊奶是继牛奶、水牛奶之后的第三大奶类资源，占总奶量的2.07%，世界上所产的山羊奶大部分以液态奶形式出售，也用于加工干酪、奶油、糖果等。山羊奶产品的成本要比牛奶高，在欧美其价格比牛奶高很多，在美国两者价格比为2∶1。因此，向羊奶中掺加牛奶可降低成本，获得更高的利润，但长此以往不利于乳业市场的发展；而对于一些牛奶过敏者则可能造成致命性的伤害。

2.2.1酶联免疫方法（ELISA）检测羊乳中的牛乳成分

ELISA方法的核心在于特异性抗体，抗体的专一性越高，检测的可信度就越高。抗体分多克隆抗体和单克隆抗体，一般单克隆抗体的专一性高于多克隆抗体。Anguita等［13］和Hurley等［14］分别用牛β-酪蛋白以及牛IgG制备牛源性单克隆抗体，建立间接ELISA反应体系，专一性结合乳中牛源性蛋白成分，检测下限可达0.5%。

2.2.2毛细管电泳在乳蛋白质掺假检测上的应用

Cartoni等［15］利用毛细管区带电泳检测羊奶产品中掺入的牛乳成分。以特异性乳清蛋白为检测物质，检测峰具有很高的分辨率，制作相对校准曲线，牛乳的最小检出量在乳混合物中体积分数2%，在奶酪中体积分数为4%。

石燕［16］、Brabant［17］、张东送等［5］在研究毛细管电泳在乳品蛋白质掺假检测上的应用时，检测牛乳中添加杂蛋白的检测情况，发现不同物种间乳的电泳图谱具有差异性，牛乳、绵羊乳和山羊乳具有不同表型的β-乳球蛋白、αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白，可以鉴别不同物种间乳的互相掺假现象。

2.2.3PCR检测分析在乳蛋白质掺假检测上的应用

ELISA方法、电泳法、色谱法等主要依赖于乳中蛋白质或氨基酸的差异，这些技术已成功应用于生乳或者鲜乳等，但是市场上诸多的奶制品经过了高温高压的处理，并添加有各种各样的食品添加剂。而蛋白质经过这些加工处理可能改变了其结构和稳定性，从而破坏物种特有的蛋白质或抗原决定部位。加之牛乳与羊乳间大部分的主要成分相似，因此这些方法在市场加工样品的检测上比较困难。基于上述这些原因，以核酸为基础的分析法显示了其优势，乳中外源蛋白质的掺入会引入该外源有机体的种属特异性遗传物质-DNA，核酸能够耐高温，检测时是基于其特定的片段，DNA的断裂对检测影响不大，可通过检测种属特异性DNA片段来间接检测外源蛋白。因此，基于核酸检测的PCR技术（包括实时荧光定量PCR）、分子杂交以及基因测序等是进行乳制品中物种判别的最佳方法。

López-Calleja等［18］使用PCR技术特异性检测绵羊和山羊乳中掺入的牛乳，PCR使用了针对线粒体中12S rRNA基因的引物以达到种属特异性。上游引物与一个保守DNA片段互补结合，下游引物与牛的特异DNA片段结合，这样就扩增出一个223 bp的牛乳中DNA片段，而绵羊和山羊的DNA片段不会得到扩增。这个技术被用在生鲜乳、巴氏杀菌乳和灭菌后的牛-绵羊和牛-山羊混合乳的检测，它能够很好的检测出混合物中的牛乳，具有灵敏的检测限体积分数0.1%。

López-Calleja等［19］使用PCR技术特异性检测绵羊乳中掺入的山羊乳，PCR使用了针对线粒体中12S rRNA基因的引物以达到种属特异性。这个山羊种属特异性引物的使用能扩增出一个122 bp的山羊乳DNA片段，而绵羊、母牛和水牛的DNA片段不会得到扩增。这个PCR分析技术被用在由山羊和绵羊二元混合的生鲜乳、高温处理乳的特异性检测上，它能够很好的检测出混合物中的山羊乳，最低检测限为体积分数0.1%。

Kotowicz等［20］采用双重PCR检测山羊乳中的牛乳，该双重PCR使用两对能识别线粒体D环片段序列的引物。该PCR检测具有很高的特异性和灵敏性，它能检测到羊奶中体积分数不到1%的牛奶成分。一对引物是特异性识别牛线粒体DNA片段，另一对引物可识别山羊和牛的线粒体DNA片段以阻止假阴性的发生。

3结论

随着人民生活水平的提高，消费者对食品的安全也越来越关注，面对牛奶掺假屡禁不绝的现象，建立奶类食品掺假的检测体系，可为食品安全提供保障，提高食品质量安全事故的应急反应，为食品安全法正确执行和实施提供先进、高效的技术手段，其应用也可促进食品工业健康稳定的发展。文中综述了对乳制品掺假鉴别的各种手段，如红外光谱法、高效液相色谱法、电泳法、比色法以及PCR方法等，这些方法检测的出发点在于所掺入的蛋白质与原有蛋白质之间存在差异性（带电性、等电点、氨基酸组成、蛋白分子的抗原决定簇、外来带入物质等）。乳品中蛋白质掺假物检测的实现离不开这些差异性，没有任何差异性作为检测依据的乳品蛋白掺假检测方法是不可能实现的。乳品蛋白掺假方法的建立一定要以某一特定的蛋白质差异性为依据。目前，乳制品中真蛋白掺假检测主要基于这些差异点建立起来的，其涉及了色谱、质谱、免疫、PCR、电泳、光谱学、分析化学等技术领域。

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Research Progress on Detection Methods of Protein Adulteration in Milk Products

JIN Ping，DING Hong-liu，CHEN Yin，LI Pei
（Suzhou Products Quality Supervision and Inspection Institute，Suzhou 215128，Jiangsu，China）

Milk adulteration has become a prominent problem in the dairy industry development in our country. This paper presents the common means of protein adulteration in milk products，and summarizes the adulteration detection method for various means，such as infrared spectroscopy，high-performance liquid chromatography，electrophoresis method，colorimetric method and PCR method，etc.

milk products；adulteration；detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.035

2013-05-15

苏州市科技计划支撑项目（SS201126）；江苏省质量技术监督局科技项目（KJ122726）

金萍（1986—），女（汉），助理工程师，硕士，研究方向：营养与食品安全。