人类受精相关精子功能蛋白质研究进展

张蔚，李建远，谷翊群＊

（1.北京协和医学院研究生院，北京 100730；2.国家卫生计生委男性生殖健康重点实验室，国家卫生计生委科学技术研究所，北京 100081）

目前不育症患病率逐年增高，全球已有约15%的夫妇患有不育症［1］。在不育症的发病因素中，男性因素占到了50%［2］，对男性不育病因的评价结果将影响不育症的治疗方法选择。现在临床上仍使用常规精液分析作为检测和评价男性生育力的主要方法，评价指标主要包括精子数量、精子运动能力和正常精子形态学的百分率，这些指标只能反映出达到自然妊娠所要求的最低精子质量，不能反映精子功能与超微结构的损伤。并且受每次射精的内在变异性与精液分析的精准性限制，常规精液分析结果并不能直接反映出精子的实际受精能力，无法准确评价男性生育力。近10年精子蛋白质组学得到长足发展［3］，尤其是比较精子蛋白质组学通过比较不同质量精液标本的蛋白质表达，能鉴定出某些可能导致男性不育的独特精子蛋白质［4］。这些与精子受精功能相关的蛋白质有可能成为诊断男性不育和评估预后的新标志物，从而能够更准确地判断男性的生育状态和生殖潜能，为患者提供更准确、更经济的治疗手段。本文按照自然状态下精子受精的生理过程对人类受精相关精子功能蛋白质予以综述，阐述这些蛋白质分子在精子受精过程中发挥的作用，并对其在评价男性生殖潜能上的应用前景予以展望。

一、精子运动及获能

精子在睾丸产生，经过附睾后形态学与功能上已经发育成熟，但还不具有使卵母细胞受精的能力［5］。只有当精子从男性生殖道射出并进入女性生殖道后，去获能因子被解除，精子膜的流动性和通透性增加［6-8］，精子发生超活化并且获能后才会快速运动突破女性生殖道生理屏障与卵母细胞相遇，继而发生顶体反应直至使卵母细胞受精［9］。与精子运动及获能有关的人类精子功能蛋白质如下：

1.去整合素区和金属蛋白酶区蛋白（ADAM）：ADAM 是近年来发现的一组锚定于细胞膜的细胞表面蛋白家族，该家族成员具有显著的结构特点，有数个较为保守的潜在功能区。目前发现人类ADAM家族有26 个成员，其中超过一半的蛋白特异性或者主要表达于睾丸和附睾组织，这意味着它们在男性生殖中发挥着重要作用［10］。大部分ADAM蛋白在生精细胞以前体形式合成，在精子发生和附睾运输中发生水解被切割成为成熟形式表达在精子表面。ADAMs多以复合物的形式存在，如ADAM1β-ADAM2，ADAM2-ADAM3-ADAM4等。ADAM 在精子运动及获能环节发挥的作用是促进精子在女性生殖道内的运动，主要由ADAM3与其它ADAM 蛋白组成复合物促进精子与输卵管上皮细胞表面的精子相关因子粘附使精子暂时储存于UTJ和输卵管峡部，而这一作用又是随后精子进入输卵管所必需的过程［11］。基因敲除动物模型证实ADAM3-／-雄性小鼠的精子由于从子宫运动至输卵管的能力受损而不育［12］。

2.CatSper蛋白：是调节Ca2＋进入精子细胞主要的电压门控通道，对于精子的运动功能非常重要。CatSper蛋白分布在精子主段的细胞膜上，人和小鼠等很多哺乳动物的CatSper通道由CatSper 1～4这4个蛋白组成，还有2 个辅助亚基CatSperβ和CatSperγ［8］。已经 证 实CatSper-／-雄 性 小 鼠 精 子 由于不能超活化从而不能穿透卵子细胞外基质导致雄性小鼠不育，人类CatSper1 基因突变会导致男性不育［13］。

3.Gelsolin蛋白：又称凝溶胶蛋白，未获能精子的Gelsolin蛋白位于人类精子尾部，当精子获能时Ca2＋浓度增加导致Gelsolin蛋白构象发生改变从精子尾部移位至精子头部暴露出纤维状肌动蛋白结合位点。由于4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2（4，5））水平增加以及络氨酸蛋白激酶SRC 家族的磷酸化使Gelsolin蛋白处于被抑制状态，肌动蛋白因此发生聚合，引发精子超活化［7］。

4.附睾蛋白酶抑制因子（Eppin）：由人睾丸支持细胞和附睾上皮细胞分泌，表达于人类精子头部顶体区和鞭毛，顶体反应后表达于赤道区和尾部。精子表面Eppin与乳铁蛋白（LTF）和凝集素（Clus-terin）形成复合物，射精时精囊腺分泌的精囊蛋白（SEMG）结合到Eppin蛋白复合物上发挥Eppin的功能［14］。Eppin的功能有：（1）与SEMG1结合调节精子表面前列腺特异抗原（PSA）的酶活性；（2）对精子产生抗菌保护；（3）作为SEMG1受体与SEMG1结合抑制精子运动。其分子机制是SEMG1 与Eppin结合后会抑制或逆转精子细胞内碱性化水平，从而抑制Ca2＋摄入，导致精子前向运动能力丧失［15］。当精液射出后精浆中的PSA 水解SEMG1随后精子获得前向运动能力。Eppin抗体与Eppin结合后会抑制细胞内Ca2＋浓度的增加阻断顶体反应的发生［16］。

5.表皮生长因子受体（EGFR）：表达于人类精子质膜上，可以直接被其配体表皮生长因子（EGF）激活，也可被蛋白激酶A（PKA）间接激活，或者由G 蛋白偶联受体（GPCRs）反式激活。精子获能时上述几个因子激活EGFR，导致磷脂酶D（PLD）活化和肌动蛋白聚合［17］。

二、顶体反应

获能的精子与卵母细胞相遇后，精子顶体在接触到卵丘细胞时诱发了精子质膜与顶体外膜的融合，顶体内的各种酶被释放出来将卵母细胞透明带水解形成入卵通道，顶体内膜上的精卵识别和融合位点暴露，这一过程称为顶体反应［6］。顶体反应是受精所必须经历的过程，只有获能且发生顶体反应的精子才能够进入卵周间隙，和卵膜接触、结合并最终融合。与顶体反应有关的人类精子功能蛋白质如下：

1.Gelsolin蛋白：在精子运动及获能中发挥着重要作用，精子获能后顶体反应发生前不久细胞内的Ca2＋浓度再次升高，激活了磷脂酶C（PLC），PLC将PIP2（4，5）水 解 使 与PIP2（4，5）结 合 的Gelsolin蛋 白被释放入胞质中。此时游离的Gelsolin蛋白因脱磷酸作用被激活，活化的Gelsolin蛋白使纤维状肌动蛋白分离从而诱发顶体反应［7，9］。

2.表皮生长因子受体（EGFR）：在获能后期，EGFR 的进一步激活增加了细胞内的Ca2＋浓度，从而激活Gelsolin蛋白，导致纤维状肌动蛋白分解，最终使顶体反应发生［7，9］。在体内，生理条件下精子蛋白激酶A（PKA）主要由HCO3-激活，而表皮生长因子（EGF）以及G 蛋白偶联受体（GPCRs）则由女性生殖道的生理成分血管紧张素Ⅱ或者溶血磷脂酸激活［17］。

3.分泌性肌动蛋白结合蛋白（SABP）：最初是从人精浆分离出来，表达于人类精子尾部中段。SABP可以和肌动蛋白结合起到类似抗肌动蛋白抗体的作用，从而抑制精子获能和顶体反应。已有研究显示少弱精子症患者SABP表达量明显高于正常对照组［18］，而反复IVF-ET 失败患者与正常生育对照组的精子蛋白质表达分析显示，IVF-ET 反复失败患者的SABP表达也明显高于对照组。

三、精子与卵母细胞透明带结合

人卵母细胞透明带由4 种糖蛋白（ZP1、ZP2、ZP3、ZP4）组成［19］，构成了精卵受精过程的屏障。顶体反应发生后、形成入卵通道之前，精子需要和透明带结合形成一种稳定的状态，这种状态对于精子随后溶解透明带是十分必要的，精子头部的蛋白是形成该状态的关键分子。与精卵结合有关的人类精子功能蛋白质如下：

1.富含半胱氨酸分泌蛋白（CRISP）：CRISP家族成员都含有16 个保守的半胱氨酸残基，其中10个聚集在C 末端。CRISP-1以雄激素依赖的方式由附睾合成，分布于顶体反应精子的赤道区。人CRISP1蛋白（hCRISP1）是一种多功能蛋白，通过抗CRISP1 抗体和重组CRISP1 蛋白作用发现hCRISP1可以与人卵母细胞透明带ZP3 特异结合［20］。

2.热休克蛋白A2（HSPA2）：人睾丸特异HSP70蛋白异构体，是一种分子伴侣。研究发现该分子伴侣与男性不育相关，在介导精卵识别中发挥重要作用［21］。作为分子伴侣，HSPA2 并不是直接参与人类精子与透明带的结合，而是通过与精子粘附分子1（SPAM1）和芳香基硫酸酯酶（ARSA）组合成多聚透明带受体复合物，间接参与精子和透明带的相互作用［22］。SPAM1具有透明质酸酶活性，可以分解卵丘复合物，ARSA 则可以直接粘附到ZP上，二者通过HSPA2 的调配来发挥各自的作用。如果没有HSPA2，作为透明质酸酶受体的SPAM1和ZP受体的ARSA 都不能发挥作用，从而无法完成受精［22-23］。

四、精卵融合

精子穿过透明带后进入卵周间隙，此时精卵膜融合是精子头部内的遗传物质输送入卵母细胞内的关键因素，也是受精成功最重要的一步。精卵膜融合是由精子膜和卵膜表面互补配对的特异性蛋白质分子介导的。与精卵融合有关的人类精子功能蛋白质如下：

1.ADAM 家族：精卵融合中主要由ADAM2与其它 ADAM 蛋白形成的复合物发挥作用。ADAM2是卵母细胞表面整合素α6β1 的受体，通过二者的相互作用增强精子质膜与卵母细胞质膜的粘附，ADAM2-／-雄性小鼠表现出精卵膜粘附和融合缺陷［24］。含有ADAM2和ADAM3的复合物在体外同样可以促进精卵相互作用。

2.IZUMO：属于I型膜蛋白免疫球蛋白超家族，具有一个细胞外Ig区和一个N 末端区。这一家族由四个蛋白组成，从1到4命名，在N 末端区有显著同源性，因此也称为IZUMO 区。IZUMO1、2和3仅表达于人睾丸表面，而4是可溶性蛋白可以在人睾丸和其他组织表达。精卵融合必需的IZUMO1在女性生殖道内运动和受精时表达于精子的不同部位，顶体反应时IZUMO1会从精子头部前区重新分布到将要发生融合的部位，也就是赤道区［25］。卵母细胞表面IZUMO1 的受体 是JUNO（叶酸受体4，以罗马的婚姻和生育女神JUNO 命名），二者互补结合后介导精卵膜融合。IZUMO1和JUNO 是到目前为止唯一确定的精卵融合必需的 配 对 受 体［26］。 已 有 动 物 实 验 结 果 表 明，IZUMO1-／-雄性小鼠可以正常交配和射精并形成阴道栓，但是由于精子不能与卵母细胞融合，导致雄鼠完全不育［25］。JUNO 在未受精卵母细胞表面高度表达，JUNO-／-雌性小鼠也由于精卵融合障碍而绝对不孕［26］。

3.富含半胱氨酸分泌蛋白（CRISP）：人CRISP1蛋白（hCRISP1）不仅介导精子与卵子透明带结合，还通过与卵母细胞表面的互补位点结合在精卵融合中发挥作用［20］。CRISP-2 则是以非雄激素依赖的方式表达于睾丸，它是一种顶体内蛋白，顶体反应后仍然存在于精子表面，在随后的精卵融合中起作用。抗人CRISP-2蛋白抗体可以抑制精子穿入卵母细胞。CRISP-1 和CRISP-2 与卵母细胞表面共同的互补位点结合，协同作用确保成功受精［27］。

4.ERp57：主要来源于人类睾丸组织生精细胞胞质以及睾丸间质细胞，睾丸支持细胞也少量产生。ERp57分泌后结合于人类精子顶体和尾部，顶体反应后移位至赤道区。精子获能时ERp57蛋白发生了翻译后修饰。用抗体阻断ERp57可以剂量依赖的方式显著抑制人类精子穿透去透明带仓鼠卵母细胞的能力。ERp57的表达水平也与生殖能力相关，IUI周期妊娠率高的捐精者其精子蛋白ERp57 的表达高于周期妊娠率低者［28］。IVF 成功率较低的患者其ERp57表达水平明显低于成功率高的患者以及已生育的捐精者。这些结果显示ERp57是人类精子顶体蛋白组成之一，在精卵融合中发挥至关重要的作用［29］。

综上所述，人类受精这一过程受到多种精子蛋白质分子的调控，但大部分蛋白质分子在精子运动活力、获能、顶体反应以及精卵融合等环节中的具体作用机理仍不是非常清楚。随着蛋白质组学研究技术的应用，发现了一些与人类精子受精相关的功能蛋白质［30］，比如临床研究中发现一些和生殖结局明确相关的蛋白质分子［28-29］，一些蛋白质分子还可以对某些疾病进行无创性诊断［30］。目前，评估男性生殖能力的方法仍然以检测精子活力、浓度、形态等常规精液分析为主，但是这一传统的评估方法并不能准确反映男性的真实生育力，因此会给患者带来不必要的时间、经济以及心理压力。个体间的受精能力差异是由受精相关的蛋白质分子组成不同导致的［31］，如果能够检测出这些与受精能力相关的蛋白质分子，建立生物标记物检测方法，对精子受精能力进行有效评价并对生殖结局进行预测，将对男性不育的临床诊断和治疗带来极大的便利。

［1］ Bhasin S.Approach to the infertile man［J］.J Clin Endocrinol Metab，2007，92：1995-2004.

［2］ Thacker S，Yadav SP，Sharma RK，et al.Evaluation of sperm proteins in infertile men：aproteomic approach［J］.Fertil Steril，2011，95：2745-2748.

［3］ Rahman MS，Lee JS，Kwon WS，et al.Sperm proteomics：road to male fertility and contraception［J］.Int J Endocrinol，2013，2013：360986.

［4］ Amaral A，Castillo J，Ramalho-Santos J，et al.The combined human sperm proteome：cellular pathways and implications for basic and clinical science［J］.Hum Reprod Update，2014，20：40-62.

［5］ Ashrafzadeh A，Karsani SA，Nathan S.Mammalian sperm fertility related proteins［J］.Int J Med Sci，2013，10：1649-1657.

［6］ Ikawa M，Inoue N，Benham AM，et al.Fertilization：a sperm’s journey to and interaction with the oocyte［J］.J Clin Invest，2010，120：984-994.

［7］ Finkelstein M，Etkovitz N，Breitbart H.Role and regulation of sperm gelsolin prior to fertilization［J］.J Biol Chem，2010，285：39702-39709.

［8］ Rahman MS，Kwon WS，Pang MG.Calcium influx and male fertility in the context of the sperm proteome：an update［J］.Biomed Res Int，2014，2014：841615.

［9］ Finkelstein M，Megnagi B，Ickowicz D，et al.Regulation of sperm motility by PIP2（4，5）and actin polymerization［J］.Dev Biol，2013，381：62-72.

［10］ Cho C.Testicular and epididymal ADAMs：expression and function during fertilization［J］.Nat Rev Urol，2012，9：550-560.

［11］ Tokuhiro K，Ikawa M，Benham AM，et al.Protein disulfide isomerase homolog PDILT is required for quality control of sperm membrane protein ADAM3and male fertility［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109：3850-3855.

［12］ Yamaguchi R，Muro Y，Isotani A，et al.Disruption of ADAM3impairs the migration of sperm into oviduct in mouse［J］.Biol Reprod，2009，81：142-146.

［13］ Avenarius MR，Hildebrand MS，Zhang Y，et al.Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1channel protein［J］.Am J Hum Genet，2009，84：505-510.

［14］ O’Rand MG，Widgren EE，Hamil KG，et al.Functional studies of eppin ［J］.Biochem Soc Trans，2011，39：1447-1449.

［15］ O’Rand MG，Widgren EE.Loss of calcium in human spermatozoa via EPPIN，the semenogelin receptor［J］.Biol Reprod，2012，86：55.

［16］ Zhang J，Ding X，Bian Z，et al.The effect of anti-eppin antibodies on ionophore A23187-induced calcium influx and acrosome reaction of human spermatozoa［J］.Hum Reprod，2010，25：29-36.

［17］ Breitbart H，Etkovitz N.Role and regulation of EGFR in actin remodeling in sperm capacitation and the acrosome reaction［J］.Asian J Androl，2011，13：106-110.

［18］ CapkováJ，Elzeinová F，Novák P.Increased expression of secretory actin-binding protein on human spermatozoa is associated with poor semen quality［J］.Hum Reprod，2007，22：1396-1404.

［19］ Avella MA，Xiong B，Dean J.The molecular basis of gamete recognition in mice and humans［J］.Mol Hum Reprod，2013，19：279-289.

［20］ Maldera JA，Weigel Muñoz M，Chirinos M，et al.Human fertilization：epididymal hCRISP1 mediates sperm-zona pellucida binding through its interaction with ZP3［J］.Mol Hum Reprod，2014，20：341-349.

［21］ Nixon B，Bromfield EG，Dun MD，et al.The role of the molecular chaperone heat shock protein A2 （HSPA2）in regulating human sperm-egg recognition［J］.Asian J Androl，2015，17：568-573.

［22］ Redgrove KA，Nixon B，Baker MA，et al.The molecular chaperone HSPA2 plays a key role in regulating the expression of sperm surface receptors that mediate sperm-egg

recognition［J］.PLoS One，2012，7：e50851.

［23］ Redgrove KA，Anderson AL，McLaughlin EA，et al.Investigation of the mechanisms by which the molecular chaperone HSPA2regulates the expression of sperm surface receptors involved in human sperm-oocyte recognition［J］.Mol Hum Reprod，2013，19：120-135.

［24］ Baessler KA，Lee Y，Sampson NS.Beta1integrin is an adhesion protein for sperm binding to eggs［J］.ACS Chem Biol，2009，4：357-366.

［25］ Klinovska K，Sebkova N，Dvorakova-Hortova K.Sperm-egg fusion：a molecular enigma of mammalian reproduction［J］.Int J Mol Sci，2014，15：10652-10668.

［26］ Bianchi E，Doe B，Goulding D，et al.Juno is the egg Izumo receptor and is essential for mammalian fertilization［J］.Nature，2014，508：483-487.

［27］ Cohen DJ，Maldera JA，Weigel Muñoz M，et al.Cysteine-rich secretory proteins （CRISP）and their role in mammalian fertilization［J］.Biol Res，2011，44：135-138.

［28］ 张斌，卞增惠，苏建堂.精子蛋白ERp57与宫腔内人工授精周期妊娠率相关性的初步分析［J］.中华男科学杂志，2009，15：354-356.

［29］ Zhang J，Wu J，Huo R，et al.ERp57is a potential biomarker for human fertilization capability［J］.Mol Hum Reprod，2007，13：633-639.

［30］ Heshmat SM，Mullen JB，Jarvi KA，et al.Seminal plasma lipocalin-type prostaglandin D synthase：a potential new marker for the diagnosis of obstructive azoospermia［J］.J Urol，2008，179：1077-1080.

［31］ Govindaraju A，Dogan S，Rodriguez-Osorio N，et al.Delivering value from sperm proteomics for fertility［J］.Cell Tissue Res，2012，349：783-793.