乙型肝炎病毒感染对辅助生殖技术的影响与探究

柳榴，文妍琪，赵萌，杨菁

（武汉大学人民医院生殖医学中心，武汉 430060）

乙型肝炎病毒（HBV）感染是全世界面临的严重公共卫生问题之一。HBV 属于嗜肝脱氧核糖核酸病毒科［1］，能引起急慢性肝炎、肝硬化，甚至肝癌等严重疾病。慢性HBV 感染是指血清乙肝表面抗原（HBsAg）阳性持续6个月以上。HBV 的感染呈世界性分布，不同地区的HBV 流行率差异较大，我国属于高发性流行地区，其慢性感染人数约占全球HBV 慢性感染人数的1／3［2］。HBV 传播途径主要有水平传播和垂直传播。水平传播是指HBV 在外环境中借助传播因素而相互传播，主要有血液（或血制品）等体液经破损的皮肤及黏膜传播、性传播和医源性传播。垂直性传播是指HBV 病毒经由亲代传给子代，包括父-婴传播和母-婴传播。

近年来，越来越多的不孕患者选择辅助生殖技术（ART）行助孕治疗，而对进行试管婴儿辅助技术治疗的不孕夫妇的血清病毒筛查时发现，HBV 慢性感染人数占有相当大的数量。从伦理学的角度来看，试管婴儿妊娠过程与自然妊娠过程相同，所以没有理由去拒绝HBsAg阳性的夫妇接受试管婴儿治疗，仅对于供卵者或供精者来说，需接受血清HBV的筛查，且最长有效期在6个月之内。因此，正确认识HBV 在ART 中可能产生的影响，对疾病有效的预防、ART 结局的预测和实验室的管理有着非常重要的意义。本文就近年来这方面的研究进展做一综述。

一、男性HBV 慢性感染在ART 过程中可能产生的影响

1.对精子质量和相关功能的影响：HBV 是一种噬肝性病毒，它不仅存在于肝脏，也存在于肝外组织如：生殖性腺、肾脏、腮腺等组织。1985 年Hadchouel等［3］首次在乙肝患者的精液中监测到有游离型和整合型HBV DNA 的存在。随后，有研究表明经HBV DNA 感染的精子与HBV 阴性配偶的卵母细胞结合后，能在受精卵内复制，最终进入胎儿组织［4-6］。其机制可能与HBV 能穿过血睾屏障，并且其DNA 整合入精子的染色体，与卵母细胞结合后随染色体进入受精卵，最终进入胚胎有关。

HBV 能够感染精子，进而对精子的质量和功能也产生影响。有研究表明HBV 感染的男性患者精液分析结果出现低密度［7-9］、低活力［7，9-10］、低正常形态 率［7，10-12］，且HBV 感 染 能 增 加 少、弱 精 子 症 和 无精子症的比例［7］。以上研究均能说明HBV 能引起精液及精子的病变。郑九嘉等［10］对273 例男性HBsAg阳性和254 例男性HBsAg 阴性患者同时进行精子DNA 碎片指数（DFI）、顶体酶活性和精子核蛋白组转换分析，发现HBsAg 阳性组精子DFI高，顶体酶活性较低。因此，得出了HBV 感染对精子DFI和顶体酶活性等功能指标造成损伤这一结论。另外，一些研究也显示HBV 感染的男性患者在ART 中 表 现 出 低 受 精 率［7，9，11］。究 其 原 因 可 能如下：（1）HBV DNA 整合入精子染色体后，能够影响精子遗传物质的稳定性，增加精子染色体畸变率，最终导致男性生殖细胞的遗传缺陷及影响精子形成［13-14］。（2）HBV 感染能够增加精子的坏死和凋亡，并导致精子膜完整性及精子线粒体膜电位的消失，最终影响精子的功能［15］。（3）HBV 在局部组织易形成抗原-抗体沉淀物，从而引起机体局部组织的炎症和免疫应答，最终对精子功能造成损伤［7］。

2.对妊娠结局的影响：目前不同学者关于男性HBV 感染对妊娠结局的影响的研究结果存在争议。Zhou等［7］和Pirwany等［16］发 现HBV 感 染 的 男 性患者表现出低着床率和临床妊娠率。而受损的精子质量可能是低着床率和临床妊娠率的原因之一。但是Lee等［12］和Bu等［17］发现男性患者的体外受精和胚胎移植（IVF-ET）治疗结局不受HBV 慢性感染的影响。甚至Lam 等［18］发现夫妻双方至少一方感染HBV 可以获得更好的IVF-ET 结局，有着更高的着床率和妊娠率，但是其具体机制仍不明确。这些差异性可能与受试者地域或人群种族的差异、实验中实验对照组配对标准的差异、以及ART 中出现的多种因素有关。因此，对于男性HBV 感染是否对ART 造成影响，仍需更加严谨的大样本研究来进一步证实。

对于男性HBsAg 阳性的不孕夫妇来说，进行ART 治疗前，女性应该注射疫苗来避免围产期对胎儿的传播，若抗乙肝表面抗原抗体（HBsAb）滴度达到10U／L，试管婴儿治疗就可以进行［19］。

二、女性HBV 慢性感染在ART 过程中可能产生的影响

1.对卵母细胞质量和卵巢储备功能的影响：有研究［4］显示，在女性慢性HBV 感染者的卵巢间质、卵巢间质细胞、卵母细胞、以及血管内皮细胞中能够检测出HBsAg 的存在。随后又有些学者发现，HBV DNA 序列能够穿过卵母细胞的透明带和细胞膜并整合于卵母细胞的基因组，然后在卵细胞的不同阶段进行复制［20-21］。Nie等［22］对女性HBsAg阳性而其配偶阴性进行HBV DNA 和RNA 的分析，发现HBsAg存在于卵母细胞的细胞核、细胞质和胚胎。以上均提示了HBV 能通过女性生殖细胞垂直传播的可能性。即HBV DNA 在基因组内存在单位点或多位点整合，HBV DNA 能够以这种方式整合入卵母细胞基因组内，并通过受精的方式传递给早期胚胎［23］。但这种垂直传播的具体机制还需进一步的研究。

HBV 能够感染卵母细胞，那么对卵巢储备功能和卵母细胞的质量能否造成影响呢？上面提到HBV 是可能影响精子遗传物质的稳定性以及通过抗原抗体复合物沉积在组织中触发炎症损伤组织，在此处这种可能性仍然适用。2013年李苗［24］通过观察HBV 感染与颗粒细胞凋亡的关系发现，HBV感染可以促进颗粒细胞凋亡。2014年Shi等［11］通过对年龄、不孕的原因以及采卵日期进行严格配对后，发现HBV 感染的女性有低优胚率、低受精率，并指出这可能与HBV 感染损伤卵细胞功能有关。卵巢储备功能指标包括基础卵泡刺激素（FSH），基础雌激素如雌二醇（E2），基础FSH／黄体生成激素（LH）比值，卵巢体积、基础窦卵泡数（AFC）及卵巢基质收缩期血流等［25］。遗憾的是，目前尚未见到专门描述HBV 感染与女性卵巢储备功能相关指标之间关系的权威报道，在这方面应值得予以更多的关注与研究。

2.对妊娠结局的影响：聂睿［26］对3 457对不孕夫妇进行HBV 感染的调查，发现不孕夫妇中HBV总感染率高于一般人群感染率，提示HBV 感染可能影响感染者的生育能力。但是目前关于HBV 不孕妇女IVF 结局的报道不多且结论并不一致。大多数研究报道女性HBV 感染对IVF妊娠结局临床妊 娠率并 无 影 响［27-28］。但 是，Lam 等［18］对34 例 女性HBV 感染组和156 例女性HBV 阴性对照组、102例按1∶3配对的女性HBV 阴性对照组进行了研究，得出了HBV 感染组相比于对照组有高植入率、临床妊娠率、继续妊娠率，但其机制不明。胚胎移植往往是在所获得的受精卵中选取最优的2或3个受精卵来进行移植，以上的这些结论还可能与优质胚胎的选择有关。但是对于女性HBV 感染是否会影响妊娠结局，这就仍然需要更多更严谨的研究报道来证实。

HBsAg阳性患者HBV 的母婴垂直传播与HBV DNA 水平或者乙肝e抗原（HBeAg）阳性有关［29］。通常认为，当血清HBV DNA≥106拷贝／ml或者HBeAg阳性时，表明病毒量高，易发生母婴传播［30］。因此，对于每一个来进行ART 治疗的HBsAg阳性女性不孕患者，应该进一步行HBV DNA的检测，若同时有HBV DNA 阳性，应该推荐其去感染科进行治疗，同时进行HBV DNA 监测，最好在病毒指数低的情况下进行辅助受精，同时应告知夫妻双方HBV 在妊娠和分娩过程中的传播可能性。

三、HBV 与胚胎实验室坏境

1.胚胎实验室环境的特殊性：HBV 在感染患者的血液中高浓度存在，且在精液或者卵泡液中的含量与血液中的量呈正相关。胚胎实验室工作者平时直接或者间接接触大量的血液、卵泡液、精液，处理标本时所用的试管、仪器以及操作时可能造成的液体飞溅，都会是实验室内环境病原体污染的来源。值得提出的是，实验室的温度和湿度以及培养体液所用的培养基都有利于HBV 的存活。

一般来说，HBV 感染是最常见的实验室获得性感染，实验室工作者感染HBV 的危险率是普通公众环境下的10倍，是其他医疗环境下的3倍。胚胎实验室工作者完全可能会通过皮肤、黏膜接触或口腔吞咽而感染。而受感染后的实验人员也会成为传染源，在胚胎操作过程中将病毒传染给胚胎。为了减少胚胎实验室的病毒传播，一个综合的安全的措施应该被制定和实施，并且需要每个实验工作者严格的遵守。建议实验工作者操作时，需把每份体液或者胚胎样品都当做已被病毒污染的一样小心对待；实验室内注意佩戴手套、隔离衣、口罩、眼罩（若必要时）；离心时需盖紧试管盖子；定期清洗实验仪器；配置专门的洗手池和洗眼池；脱衣和摘手套后立即洗手，尤其是当其污染后；禁止在实验室里吃喝、吸烟、化妆；禁止在储存标本或实验试剂的冰箱里存放食物；最后推荐所有健康的实验工作者都应该注射HBV 疫苗［31］。

2.精、卵以及胚胎能够感染外源性的HBV DNA：正常的活精子具有结合外源HBV DNA 的能力，并能在与卵母细胞受精时转入卵细胞内，进而传递给子代［32］。在胚胎实验室往往需要对精液进行洗涤并去除精浆，而有研究报道去除精浆后的精液更容易捕获外源HBV［33］。同样也有实验动物研究，对小鼠卵母细胞进行体外研究显示：卵母细胞能够被动地摄取外源性HBV［34］。胚胎作为一个移植物，外界环境中HBV 能够感染胚胎并在胚胎内得到稳定的表达。因此，如何防止HBV 在实验室中的传播成为每个胚胎实验室工作者关注的焦点。周桦等［35］给出了如下几点建议：（1）洗涤HBV 病毒感染的配子和胚胎，对于减少病毒拷贝数能起一定的作用；（2）对HBV 感染的不孕患者进行取卵手术或者胚胎移植手术时，应该尽量按照HBV 感染者—HBV DNA 阴性的HBV 感染者—HBV DNA 阳性的HBV 感染者的顺序来进行；（3）封闭式玻璃化冷冻法代替开放式冷冻法，避免交叉污染；（4）亚甲蓝光化学法对HBV 感染者的精液或卵泡液灭活病毒也是一个较好的选择；（5）建议对HBV 感染者有单独的配子及胚胎处理室，并使用固定的培养箱和保存用的液氮罐，以避免交叉污染。

总之，随着越来越多的不孕患者选择ART 方式来进行助孕治疗，在这个治疗过程中往往会出现许多高风险的情况需要进行调控，HBV 感染是其中之一。虽然已指出HBV 感染在夫妻双方生殖细胞的垂直传播及能对生殖细胞造成损伤，但是对妊娠结局的影响及其具体产生的机制仍有待于进一步的研究。HBV 不仅对双亲和子代带来影响，对实验工作者和医护人员同样带来风险。因此，重视HBV感染可能在ART 中带来的影响，对该疾病有效地预防、ART 结局的预测和实验室的管理有着非常重要的意义。

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