金银花中黄酮类化合物的提取及其检测方法的研究进展

李杰，和素娜，杨晖，王学廷

（河南科技大学医学院，河南洛阳471003）

金银花中黄酮类化合物的提取及其检测方法的研究进展

李杰，和素娜，杨晖，王学廷

（河南科技大学医学院，河南洛阳471003）

黄酮类化合物是金银花的有效成分之一，具有优良的抗氧化、清除自由基、抗炎及调节心血管系统等作用。目前金银花中黄酮类化合物的提取方法主要包括浸提法、乙醇回流法、超声波法和微波法，但对其纯化方法的研究还比较欠缺。通常采用紫外可见分光光度法、高效液相色谱法和毛细管电泳法来检测金银花提取液中的黄酮类化合物，相比较而言紫外可见分光光度法最为常用，接下来是高效液相色谱法，最后为毛细管电泳法。对金银花中黄酮类化合物的提取工艺及其检测方法做了简单的综述，旨在为我国的金银花以及金银花中黄酮类化合物的开发、研究、利用提供借鉴。

金银花；黄酮类化合物；提取；检测

金银花（Flos Lonicerae）为忍冬科忍冬属植物忍冬的干燥花蕾，又名忍冬花、双花，具有清热解毒、凉散风热之功效，是我国传统的药食同源植物。研究表明金银花中含有挥发油［1］、多糖［2-3］、黄酮类［4-5］、有机酸类［6-7］、三萜类［8-9］等多种化合物。早期对于金银花的研究主要集中在有机酸类的研究，尤其是绿原酸的研究。随着研究的深入，人们发现金银花中的黄酮类化合物也具有优良的生理活性，如抗菌、抗病毒、增强机体免疫力、抗氧化及抗自由基、抗癌、防癌和抑制脂肪酶等，并且无毒无害。因此，对金银花中黄酮类化合物的研究引起了广大学者的重视，研究进展很快。

黄酮类化合物（Flavonoids）是植物在长期自然选择过程中产生的一类次生代谢产物［10］。黄酮类化合物大致分为：黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、异黄酮类等。金银花中所含有的黄酮类化合物主要隶属于黄酮和黄酮醇两类。在我国金银花作为经济型作物在各省区均有大规模的人工种植区，资源丰富。因此，为了更好的开发、利用好我国的金银花资源，本文对金银花中黄酮类化合物的提取方法与检测技术的研究进展进行了综述。

1金银花中黄酮类化合物的提取方法

1.1浸提法

周才琼［11］以乙醇溶度、浸提时间和物料比为因素，进行正交试验，探讨了金银花中黄酮类化合物浸提法提取的最佳工艺条件。结果表明，乙醇溶度对金银花中黄酮类化合物的提取效果影响显著，其次是物料比，最后是浸提时间，认为金银花中黄酮类化合物浸提法的最佳提取工艺为：乙醇浓度90%，物料比1∶12，浸提温度70℃，浸提时间60 min。

1.2乙醇回流法

沈玲玲［12］探讨了回流温度对总黄酮提取的影响，试验结果表明乙醇浓度和回流温度对黄酮类化合物的提取影响高度显著，料液比影响不显著，提取时间的影响可忽略。筛选出了金银花中黄酮类化合物的最佳提取工艺：40%乙醇为提取剂，料液比为1∶20，80℃提取3 h，黄酮类化合物的单位浸出量为111.03 mg/g。贾霖［13］讨论了乙醇体积分数、提取温度、提取时间和料液比对黄酮提取的影响，并以乙醇体积分数、提取温度和料液比为因素进行正交试验，发现料液比对黄酮类化合物的提取影响最大，然后依次是提取温度和乙醇浓度，最佳提取条件为：提取温度60℃，乙醇浓度60%，料液比1∶15 g/mL，提取4 h，黄酮提取率为10.49%。关炳峰［14］采用旋转正交设计，对影响金银花中黄酮类物质提取率的关键因素及相互作用进行了探讨，得出了乙醇回流提取的最佳工艺：乙醇浓度65%，提取温度为65℃，提取时间1.75 h，料液比1∶15 g/mL，提取3次，金银花中黄酮类物质的提取量达128.60 mg/g。

1.3超声波辅助提取法

超声波辅助提取主要利用超声波在溶剂和提取样之间产生的空化作用，在其作用下，溶液内部产生强的冲击波和微射流，局部产生高温、高压，导致多重次级效应，如击碎、乳化、扩散和强烈的机械振荡等，从而加快体系的传质和传热速率。

李晓军［15］以超声时间、超声功率和料液比为自变量，利用响应曲面法对金银花中黄酮类化合物的超声提取工艺参数进行了优化研究。结果显示当超声时间为21.35 min，超声功率为472.24 W，料液比为1∶34.62，提取2次时，黄酮类化合物的提取效果最佳，在此工艺下金银花中的总黄酮提取率为8.87%，与金银花总黄酮提取率的理论值9.09%相近。说明采用响应曲面法优化得到的工艺参数准确可靠，具有实用价值。许灵君［16］采用乙醇-硫酸铵双水相体系协同超声提取金银花中的黄酮类化合物，通过单因素和正交试验考察了提取时间、料液比、醇水比和硫酸铵浓度对总黄酮提取率的影响。正交试验结果表明各因素影响强弱依次为：醇水比、硫酸铵浓度、提取时间、料液比；最优化条件为60%乙醇，料液比1∶25，醇水比0.7，硫酸铵浓度0.27 g/mL，50℃超声提取75 min。

1.4微波辅助提取法

微波辅助提取法是利用分子极化或离子导电效应直接对物质进行加热，因此热效率高、升温快速均匀。微波提取法具有选择性高、操作时间短、溶剂消耗量少、提取效率高、污染小等优点。

梁萱［17］通过单因素和正交试验，对微波辐射下的溶剂溶度、温度、微波辐射时间、料液比对黄酮类化合物提取的影响进行了研究。通过对正交试验结果的分析发现，影响金银花中黄酮提取的因素依次是微波辐射时间、料液比、乙醇浓度、提取温度。最佳工艺条件是：提取温度50℃，料液比1∶30，乙醇浓度80%，微波辐射时间45 min。在最佳工艺条件下，黄酮的得率为4.45%。李菁［18］采用微波法对金银花不同花期中的总黄酮进行了测定，并在单因素试验的基础上，采用正交试验法对料液比、微波功率、提取温度和提取时间等条件进行优化，筛选出其最佳提取工艺参数，即料液比为1∶10，微波功率500 W，提取温度50℃，提取时间20 min。

1.5其它提取方法

靳学远［19］采用超临界CO2萃取技术萃取金银花中的总黄酮，并同热醇浸泡法、微波辅助提取法和超声辅助提取法进行了对比。得到超临界CO2萃取的最佳条件为：压力30 MPa，温度40℃，时间120 min，夹带剂（无水乙醇）用量4.5 mL，总黄酮提取率最高为10.24%。同上述3种方法相比，超临界CO2萃取法得率高、时间短。

纵伟［20］应用超高压技术提取金银花中的黄酮类化合物，采用正交试验的方法考察了粉碎度、超高压压力、保压时间及固液比对黄酮类化合物提取的影响。通过对试验结果的极差分析可知各因素对黄酮类化合物提取得率的影响程度依次是保压时间、粉碎度、压力和固液比。最佳提取条件为，保压时间5 min，压力360 MPa，粉碎度80目，固液比1∶14。在最佳条件下，黄酮化合物的提取率为13.56%，高于热醇浸泡法、微波法和超声法。

谢威［21］在复合酶的存在下，采用恒温水浴法提取金银花中的黄酮类化合物，从正交试验结果和方差分析结果可知，各因素的影响程度是：温度、酶加量、提取时间、酶比例和搅拌速度。最佳试验条件为：提取温度80℃，酶总量0.12 g（纤维素酶∶果胶酶=1∶1），转速800 r/min，提取时间50 min，黄酮类化合物的提取率为4.60%。

2黄酮类化合物的检测方法

2.1紫外分光光度法

紫外分光光度法是测定黄酮类化合物含量常用的方法。通常在碱性条件下，以芦丁作为对照品，NaNO2-Al（NO3）3为显色剂，显色反应后，检测溶液在510 nm处的吸收强度，来确定黄酮类化合物的含量。郭亚建［22］对这种方法的专属性进行了研究，发现具有邻二酚羟基的非黄酮类物质会对检测结果产生很大的影响，并且此法不能检测出黄酮类成分的黄岑素、山柰酚。马陶陶［23］对此法进行了改进，以甲醇为溶剂，在pH为5.2的NaAC-HAc缓冲盐溶液的体系下，加入2 mL 0.1 mol/L AlCl3显色剂，40℃水浴10 min，提高了该法的准确度，并且消除了含有邻二酚羟基的非黄酮类化合物的干扰。由于甲醇的溶解范围有限，并且有一定的毒性，裴咏萍［24］用乙醇代替了甲醇，得到了该法的最优条件：0.5 mL 0.1 mol/L AlCl3显色剂，缓冲盐溶液pH为6.3，20℃～30℃显色15 min。

王珂［25］以5，7-二羟基-6，4ˊ-二甲基黄酮为对照品，采用三波长分光光度法检测金银花及叶中的的总黄酮含量，三波长分光光度法能有效的消除吸收峰不对称给定量分析造成的影响，并能校正干扰组分可能产生的线性吸收，测量结果更加准确、可靠。

2.2高效液相色谱法

黄雄［26］建立了同时检测金银花提取液中绿原酸和4种黄酮成分，即芦丁、木犀草素7-O-β-D-半乳糖苷、忍冬苷和槲皮素含量的高效液相色谱法，具体条件如下：色谱柱Aglient Zorbax 80A（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.5%磷酸，梯度洗脱，流速为1 mL/min，检测波长355 nm，柱温30℃，进样量10 μL。在上述条件下，5个峰的分离度大于1.5，色谱峰完全分开。5个化合物的标准曲线呈良好的线性关系，该法适合同时测定金银花中绿原酸和黄酮类成分的含量。

王丽婷［27］建立了金银花及其叶中黄酮类物质槲皮素和木犀草素的含量测定方法：色谱柱为Zorbax 80A，Extend-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），以甲醇-0.02%磷酸（50∶50）为流动相，流速为1 mL/min，检测波长350 nm，柱温30℃，进样量10 μL。槲皮素和木犀草素分别在4.0 μg/mL～20 μg/mL和3.8 μg/mL～19 μg/mL的浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系，相对标准偏差在0.32%～3.34%之间。

胡海山［28］开发出了高效液相色谱法同时检测金银花中3种有机酸（绿原酸、咖啡酸和阿魏酸）和3种黄酮类物质（芦丁、木犀草苷和槲皮素）含量的方法，色谱柱：Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液，流速：1 mL/min，梯度洗脱，柱温：室温，检测波长：355 nm，进样量：20 μL。6个组分特征峰的峰面积标准偏差RSD≤0.92%，说明该方法的测量结果准确、重现性好，同时该法改变了把有机酸和黄酮类分离后再测定的方法，节省了时间。

蔡熠［29］以Diamonsil C18柱（150mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，甲醇-0.2%三氟乙酸（55∶45）为流动相，流速1 mL/min，在检测波长350 nm，柱温25℃，进样量20 μL的条件下，检测金银提取液中的槲皮素和木犀草素，结果表明槲皮素在5 mg/L～100 mg/L的范围内线性关系良好，相对标准偏差为1.33%（n=3）。木犀草素在0.25 mg/L～5 mg/L的范围内线性关系良好，相对标准偏差为1.13%（n=3）。

2.3毛细管电泳法

颜流水［30］建立了测定金银花中绿原酸、芦丁和槲皮素的毛细管电泳方法，采用熔融石英毛细管（64.5cm× 50 μm，有效长度56 cm），作为分离通道，以30 mmol/L硼砂（pH=9.3）为缓冲溶液，分离电压20 kV，毛细管柱温25℃，绿原酸检测波长为340 nm，芦丁和槲皮素的检测波长为270 nm。在15 min内3种组分实现了有效分离，3种组分在5 mg/L～200 mg/L的浓度范围内线性关系良好，相对标准偏差分别为2.4%、1.4%和2.9%（n=5）。

王海燕［31］建立了同时检测金银花中芦丁、绿原酸、槲皮素和咖啡酸含量的毛细管电泳分析方法，采用未涂层弹性石英毛细管柱（50.0 cm×75 μm，有效长度40 cm），20 mmol/L pH=9.5的硼砂为缓冲溶液，分离电压20 kV，柱温25℃，PDA检测器，检测波长220 nm，阳极压力进样0.5 psi×3 s。结果显示，芦丁、绿原酸、槲皮素和咖啡酸在2.5 μg/mL～500 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，4种组分的相对标准偏差分别为1.9%，2.3%，1.1%和2.4%。

2.4其它检测方法

薛长晖［32］采用胶束增敏荧光法对金银花中的黄酮类化合物进行了含量测定，以芦丁为对照品，激发波长为433 nm，发射波长为495 nm。通过研究测定时间、干扰离子、表面活性剂、温度以及pH对含量测定的影响，优选出了胶束增敏荧光法的最佳测定条件：室温20℃，静置15 min，醋酸钠-醋酸缓冲液pH为11，表面活性剂为环糊精，其质量分数为0.02%。Ca2+、淀粉、葡萄糖对该法基本无影响，但Fe3+对检测的干扰很大。

3结语

随着对金银花研究的深入，其中包含的化学组分和有效成分也在不断的得到阐明。虽然目前金银花中黄酮类化合物的提取方法较多，但是单一化学组分的分离和纯化研究还比较匮乏，阻碍了黄酮类化合物的发展。因此需要利用先进的科学技术对金银花的黄酮粗提取物进行分离纯化，来深入研究其药理作用，这对阐明黄酮类化学物的药理作用，开发、研制新型药物都具有重大意义。此外，开发、优化金银花中黄酮类化合物含量的测定方法，对提高金银花的质量控制水平有着非常重要的现实意义，同时也可为金银花的开发、利用提供重要的理论参考。

［1］梁倩，王俊儒，梁宗锁，等.金银花挥发油GC指纹图谱研究［J］.中国中药杂志，2008，33（20）:2359-2361

［2］殷洪梅，吕新勇，萧伟.金银花多糖的制备工艺优化及免疫活性研究［J］.中国中药杂志，2010，35（4）:453-455

［3］周小楠，董群.正交试验优化酶法提取金银花中多糖工艺［J］.食品科学，2012，33（22）:119-122

［4］王芳，蒋跃平，王晓良，等.金银花的化学成分研究［J］.中国中药杂志，2013，38（9）:1378-1385

［5］贾霖，黄国清，肖军霞.金银花中黄酮类化合物的提取工艺［J］.食品研究与开发，2013，34（9）:41-43

［6］向增旭，高山林，郭巧生.不同产地金银花种质资源化学成分含量比较［J］.中国中药杂志，2007，32（23）:2554-2556

［7］李建军，贾国伦，王君，等.金银花日不同时间和年不同茬次指标成分含量变化趋势［J］.中国中药杂志，2014，39（7）:1225-1228

［8］Min Chen，Si Qi Luo，Hui Ting Li.Chemical constitutes of Lonicera macrathoides Part 1［J］.Chin Chem Lett，1990，1（3）:219-221

［9］王燕，王智民，林丽美，等.金银花及其同属植物化学成分研究进展［J］.中国中药杂志，2008，33（8）:968-972

［10］延玺，刘会青，邹永青，等.黄酮类化合物生理活性及合成研究进展［J］.有机化学，2008，28（9）:1534-1544

［11］周才琼，李书文，万宇波，等.金银花花叶总黄酮类化合物的最佳提取工艺研究［J］.西南农业大学学报，2003，25（3）:262-264

［12］沈玲玲，胡志军，王志良，等.金银花中总黄酮的提取及消除自由基的研究［J］.时珍国医国药，2011，22（5）:1169-1171

［13］贾霖，黄国清，肖军霞.金银花中黄酮类化合物的提取工艺［J］.食品研究与开发，2013，34（9）:41-43

［14］关炳峰，王永，郭良起，等.响应面法优化金银花中黄酮类物质提取条件［J］.食品工业科技，2014，35（11）:243-246，251

［15］李晓军，盘宏利，陈花，等.响应曲面法优化超声辅助提取金银花总黄酮［J］.陕西师范大学学报（自然科学版），2009，37（2）:81-86

［16］许灵君，欧阳玉祝，吴道宏，等.双水相体系协同超声提取法分离金银花总黄酮［J］.食品与发酵工程，2010，46（6）:93-96

［17］梁萱，赵建军，梁永锋.金银花中黄酮提取工艺研究及野生与人工种植金银花中黄酮含量的比较［J］.中南药学，2013，11（3）:173-175

［18］李菁，侯飞燕，李荣东，等.金银花中总黄酮微波辅助提取工艺优化及其含量动态变化［J］.中南药学，2014，12（1）:32-36

［19］靳学远，安广杰.超临界流体提取金银花中总黄酮研究初报［J］.食品科学，2007，23（9）:156-158

［20］纵伟，李晓.超高压法提取金银花中总黄酮的研究［J］.食品研究与开发，2009，30（2）:65-68

［21］谢威，李红梅，黄增尉，等.金银花叶中黄酮提取方法的研究［J］.中国食品添加剂，2013（6）:82-86

［22］郭亚建，范莉，王晓强，等.关于NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法测定总黄酮方法的探讨［J］.药物分析杂志，2002，22（2）:97-99

［23］马陶陶，张群林，李俊，等.三氯化铝比色法测定中药总黄酮方法的探讨［J］.时针国医国药，2008，19（1）:54-56

［24］裴咏萍，李维林，张涵庆.三氯化铝比色法测定中药中总黄酮含量的方法改进［J］.现代中药研究与实践，2009，23（4）:58-60

［25］王柯，王勇，赵东宝，等.三波长分光光度法测定金银花及叶中总黄酮［J］.分析实验室，2011，30（2）:28-31

［26］黄雄，李萍，张重义，等.HPLC同时分析金银花中绿原酸和黄酮类成分的方法建立及其应用［J］.中国药学杂志，2005，40（10）: 780-782

［27］王丽婷，杨敏丽.高效液相色谱法同时测定金银花及叶中的黄酮类物质［J］.时针国医国药，2007，18（8）:1850-1851

［28］胡海山，余燕影，万春华，等.高效液相色谱法同时测定金银花中6种成分［J］.现代科学仪器，2008（5）:61-63

［29］蔡熠，郁颖佳，归靓，等.微波辅助萃取-高效液相色谱法测定金银花药材中槲皮素和木犀草素的含量［J］.中国临床药学杂志，2010，19（4）:236-239

［30］颜流水，温振东，黄智敏，等.毛细管电泳法测定金银花中绿原酸、芦丁和槲皮素［J］.药物分析杂志，2007，27（3）:367-370

［31］王海燕，李玉琴，郑晓园.毛细管电泳法测定金银花中芦丁、绿原酸、槲皮素和咖啡酸的含量［J］.西北药学杂志，2012，27（6）:521-523

［32］薛长晖.胶束增敏荧光法测定金银花中黄酮的含量［J］.辽宁农业科学，2010（5）:47-49

Progress on Extraction and Determination Methods of Flavonoids in Flos Lonicerae

LI Jie，HE Su-na，YANG Hui，WANG Xue-ting
（Medical College，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，Henan，China）

Flavonoid is an effective ingredient of Flos lonicerae，which has strong biological and physiological activity，such as antioxidant，scavenging free radicals，anti inflammatory，regulating the cardiovascular system and so on.At present，the main extraction methods of flavonoids from flos lonicerae include：impregnation method，ethanol reflux method，ultrasonic extraction method and microwave extraction method.However，there is few research on purification method of flavonoids.The ultraviolet spectrophotometry，high performance liquid chromatography（HPLC）and capillary electrophoresis were used to characterize the flavonoids.Among them，the ultraviolet spectrophotometry was the most common method.In this paper，the flavonoids extraction and determination method were interviewed，which could provide reference for the research，development and application of flavonoids in flos lonicerae in the future.

flos lonicerae；flavonoids；extraction；determination

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.043

2015-03-30

河南科技大学青年科学基金资助项目（2015QN050）

李杰（1982—），男（汉），助理实验师，硕士，研究方向：天然药物活性成分的提取和检测。