不同分析技术对不同类型标本的EGFR基因突变检测分析比较*

山西省肿瘤医院(研究所)中药制剂室 (太原 030013)

朱秀卿 阎克里△# 史艳春△ 刘芳芳△

不同分析技术对不同类型标本的EGFR基因突变检测分析比较*

山西省肿瘤医院(研究所)中药制剂室 (太原 030013)

朱秀卿 阎克里△#史艳春△刘芳芳△

目的： 比较DHPLC法和ARMS技术检测非小细胞肺癌患者3种不同类型标本的EGFR基因突变情况。方法：收集50例非小细胞肺癌患者的新鲜肺癌组织标本、石蜡切片和血液标本。分别用DHPLC法和ARMS技术同时检测其3种不同类型标本的EGFR基因的突变情况。再用直接测序法来检验以上3种类型标本的EGFR基因突变情况。结果：DHPLC法与直接测序法结果大致相同，ARMS技术检出率明显高于DHPLC法，两组新鲜肺癌组织标本的检出率差异具有统计学意义(P<0.05)，石蜡切片标本和血液标本的检出率差异不具有统计学意义(P<0.05),(P<0.05)。ARMS技术中3种类型标本的检出率相比，差异不具有统计学意义(P<0.05)。结论 ：ARMS技术检测新鲜肺癌组织EGFR基因突变的检出率明显高于DHPLC法和直接测序法，全血标本的DHPLC法可作为EGFR基因的初筛检测， ARMS技术可用于无法确认的EGFR突变基因检测。

表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)表达于正常上皮细胞表面，但许多肿瘤中常有突变型EGFR的存在，从而导致EGFR的过表达，EGFR的过表达和肿瘤细胞的转移、侵润、预后差等有关[1]。研究发现，EGFR酪氨酸激酶区域的突变主要发生在18到21外显子，其中以19和21号外显子突变为主，覆盖突变达90%[2]。

肺癌是我国乃至世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,其中非小细胞型肺癌(Non-smallcelllungcancer，NSCLC)约占所有肺癌的80%，NSCLC包括鳞状细胞癌(鳞癌)、腺癌、大细胞癌等。一部分非小细胞型肺癌患者对EGFR-TKI治疗敏感，由于NSCLC患者的EGFR基因突变与酪氨酸激酶区域密切相关[3]。本研究小组就DHPLC法、ARMS法和直接测序法对EGFR 基因突变的检测及其对于不同标本的检出率进行研究分析，现报道如下。

资料与方法

1 一般资料 选取我院自2014年5月至2015年5月期间收治入院的非小细胞肺癌患者50例为研究对象(均经我院病理科报告为病理诊断NSCLS患者)，其中男性37例(占74%)，女性13例(占26%)；年龄31～79岁，平均 49.2±12.7岁；包括鳞癌21例、腺癌18例、腺磷癌6例、细支气管肺泡癌3例、粘液表皮样癌2例；其中有吸烟史者38例，无吸烟史者12例。分别收集以上患者的新鲜肺癌组织标本、石蜡切片和血液标本各50例。

2 方 法

2.1 主要仪器设备与试剂：DNA 提取试剂盒，超净工作台，WAVER核苷酸片段分析仪(TRANSGENOMIC公司)，PCR仪(MJ Research公司)，移液器、低温离心机(Eppendorf公司)，dNTP Mix(MBI Fermentas公司)，超高保真DNA聚合酶(Stratagene公司)，DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen公司)，PCR引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)；7500实时PCR操作系统，全自动多功能酶标检测仪(Thermo 公司)，ADx®-EGFR试剂盒(厦门艾德生物医药科技有限公司)等等。

2.2 实验方法：分别用DHPLC法和ARMS技术同时检测50例非小细胞肺癌患者新鲜肺癌组织标本、石蜡切片和血液标本中的EGFR基因的突变情况。再用直接测序法来检验以上3种类型标本的EGFR基因突变情况。对比分析上述3种类型标本的不同检测方法的EGFR基因突变检测结果，比较以上DHPLC法和ARMS技术两种检验技术EGFR基因突变的检出率、比较DHPLC法和ARMS技术两种检验技术与直接测序法检测的差异及3种不同标本的EGFR基因突变检出率。评估最适合临床应用于EGFR-TKI靶向治疗前后的EGFR基因突变的检测方法及标本类型。

3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件卡方检验对以上3种方法EGFR突变检出率的差异进行数据分析，计数资料采用c2检验，以百分率(%)来表示，P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

用DHPLC法检测50例非小细胞肺癌患者新鲜肺癌组织标本、石蜡切片和血液标本中的EGFR基因的突变情况，其阳性检出率分别为新鲜肺癌组织标本12例(占24%)、石蜡切片12例(占24%)和血液标本11例(占22%)；用ARMS技术检测50例非小细胞肺癌患者3种类型标本的EGFR基因的突变情况，其阳性检出率分别为新鲜肺癌组织标本22例(占44%)、石蜡切片18例(占36%)和血液标本19例(占38%)；用直接测序法检测50例非小细胞肺癌患者3种类型标本的EGFR基因的突变情况，其阳性检出率分别为新鲜肺癌组织标本13例(占26%)、石蜡切片12例(占24%)和血液标本12例(占24%)；DHPLC法检测结果与直接测序法一致，ARMS技术检出率明显高于DHPLC法，两组新鲜肺癌组织标本的检出率差异具有统计学意义(c2=4.46，P=0.035)，石蜡切片标本的检出率差异不具有统计学意义(c2=1.71，P=0.19), 血液标本的检出率差异也不具有统计学意义(c2=3.05，P=0.05)。ARMS技术中3种类型标本的检出率相比，差异不具有统计学意义(c2=0.73，P=0.05)。

讨 论

表皮生长因子受体对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥着重要的作用[4]。有研究表明[5]，实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达，EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。可能是由于EGFR的高表达引起下游信号传导的增强，也可能是突变型EGFR受体或配体表达的增加导致EGFR的持续活化都有待进一步证实。

非小细胞型肺癌生长分裂较慢,扩散转移相对较晚，但75%的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。EGFR酪氨酸激酶区域的突变使得非小细胞型肺癌的治疗与酪氨酸激酶抑制剂息息相关，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)是目前被普遍接受的用于EGFR 基因突变的NSCLC 患者的靶向治疗药物。关于EGFR-TKI治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的国内外报道也屡见不鲜，因此对于EGFR 基因突变的检测显得尤为重要。目前医学实验室常用的几种EGFR 基因突变的检测方法有直接测序法(Direct sequencing)、Sanger双脱氧链终止法 (Sanger测序法)、突变扩增阻滞系统(Amplification refractory mutation system，ARMS技术)、变性高效液相色谱原理(DHPLC技术)、荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization ，FISH)，本研究小组就此进行研究分析，得出以下结论：ARMS技术检测新鲜肺癌组织EGFR基因突变的检出率明显高于DHPLC法和直接测序法，而DHPLC法随与直接测序法检出率无太大差异，但DHPLC法操作更简便，成本较低。全血标本的DHPLC法检测非小细胞肺癌的EGFR基因可作为初筛检测，对于无法确认的EGFR突变基因可采用ARMS技术检测患者的新鲜肺癌组织EGFR基因。

[1] 王孟昭，陈闽江. 表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂对非小细胞肺癌患者中枢神经系统转移的疗效[J]. 中华结核和呼吸杂志,2014,37(3):169-171.

[2] 张永奎，竺王玉，何剑营，等. 舟山海岛地区非小细胞肺癌EGFR基因19和21外显子突变与临床病理特征的关系[C]. 2012.

[3] 王生海. HSP90α在非小细胞肺癌中表达与EGFR基因突变在肺腺癌中关系的研究[D]. 河北医科大学,2014.

[4] Huang Z, Wang Y, Nayak PS,etal. Stretch-induced fetal type II cell differentiation is mediated via ErbB-ErbB4 interactions,” e[J]. Journal of Biological Chemistry,2012,287,(22):18091-18102.

[5] Kumar A, Kumar M, Jaiswal R,etal. Presence of Human papilloma virus and EGFR expression does not predict response to Neoadjuvant chemotherapy in oral cancer[J]. World Journal of Surgical Medical & Radiation Oncology,2012,1(20):103-110.

(收稿：2015-06-20)

*山西省卫生厅科研课题(201201007)

肺肿瘤 @EGFR基因 基因转变

R734.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.12.051

△山西省肿瘤医院(研究所)药理研究室

#通讯作者