102例急性白血病的细胞形态学、免疫学及分子生物学分型

2015-04-05唐艳萍张力图蔡政民唐亚梅苏程琳谭晓玉谢雨萱利基林广西医科大学附属肿瘤医院南宁530021

山东医药 2015年3期

唐艳萍，张力图，蔡政民，唐亚梅，苏程琳，谭晓玉，谢雨萱，利基林(广西医科大学附属肿瘤医院，南宁 530021)

唐艳萍，张力图，蔡政民，唐亚梅，苏程琳，谭晓玉，谢雨萱，利基林(广西医科大学附属肿瘤医院，南宁 530021)

摘要：目的观察102例急性白血病的细胞形态学、免疫学及分子生物学分型结果。方法采用细胞形态学分型、流式细胞学免疫分型、多重巢式RT-PCR检测白血病融合基因三项技术对102例急性白血病患者进行综合诊断分析。结果102例白血病患者按FAB分型诊断为ALL 51例，AML 45例，难分类白血病(UAL)6例。FAB分型无法确诊的6例UAL患者经流式免疫分型后诊断为2例B-ALL、3例B /T细胞系白血病和1例急性混合型白血病(髓系/B细胞系)，其余96例患者与流式分型结果一致，诊断为B-ALL 36例，T-ALL 15例，AML 45例。102例急性白血病患者中检出融合基因36例(35.3%)，包括PML/RARα、CBFβ/MYH11、AML1/ETO、TLS/ERG、TEL/AML1、E2A/PBX1、MLL/AF9、MLL/AF4、BCR/ABL 9种融合基因。结论FAB分型对UAL无法确诊时，与细胞免疫学及分子生物学分型联合，可使白血病分型更为精确、客观。

关键词：急性白血病；形态学分型；免疫学分型；融合基因

传统细胞形态学检查是诊断白血病的基础，诊断标准简便，然而光镜下形态学观察和细胞化学方法对细胞识别力有限，对于未分化型白血病及一些形态学不典型的白血病，难以准确分型，其诊断有一定的局限性[1]。目前，WHO要求白血病的诊断标准是细胞形态学、免疫学、细胞遗传学和分子学生物学的实验室诊断、临床症状、体征的联合诊断法。本研究以102例急性白血病患者为对象，以形态学、免疫学、分子学生物学特征相结合的方式，采用细胞形态学分型、流式细胞学免疫分型、多重巢式检测RT-PCR白血病融合基因三项技术进行综合判断，以使白血病的诊断分型更加科学化和规范化。

1资料与方法

1.1临床资料广西医科大学附属肿瘤医院2011年8月～2013年12月收诊的102例急性白血病初治患者。男72例、女30例，年龄2～80岁。患者均经骨髓细胞形态学检查确诊，符合WHO的FAB诊断标准。ALL 51例，AML 45例，难分类白血病(UAL)6例。

1.2主要仪器及试剂Beckman-Coulter Epics XL流式细胞仪(Beckman-Coulter公司)；TProfessional热循环仪(biometra公司)；UVI FireReader 凝胶成像系统(UVITEC公司)；MK-20干式恒温仪(杭州奥盛)。单克隆抗体：异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鼠抗人单克隆抗体CD20、sIgM、cIgM、CD5、CD7、TdT、HLA-DR、CD13、 MPO；藻红蛋白荧光素 (PE)标记的鼠抗人单克隆抗体CD2、CD10、CD22、CD33、CD117、cCD79a；藻红蛋白—得克萨斯红(ECD)标记的鼠抗人单克隆抗体CD3、CD14、CD19、CD34、cCD3；藻红蛋白—花青素(PE-Cy5)标记的鼠抗人单克隆抗体CD45；溶血剂、破膜剂、固定剂、鞘液(PBS)均购自Beckman-Coulter公司。

1.3方法

1.3.1标本处理严格按无菌操作规程，取患者骨髓，每管2～3 mL，EDTA抗凝，混匀，分别行细胞形态学检查、流式细胞学免疫分型及融合基因检测。

1.3.2细胞形态学检查患者骨髓涂片，行免疫组化染色分析白血病的分型(FAB分型)。

1.3.3流式细胞学免疫分型采用四色荧光素(FITC、PE、PC5、ECD)标记法进行骨髓血细胞免疫表型分析。细胞膜抗体标记：取15 μL样品与单抗5 μL混匀后室温避光孵育15 min，加入600 μL溶血剂混匀避光孵育15 min，鞘液洗涤2次，100 μL鞘液重悬即可上机检测。胞质内抗体标记：取15 μL样品与5 μL CD45混匀后室温避光孵育15 min，加固定剂避光孵育15 min后鞘液洗涤，加40 μL破膜剂避光孵育15 min，加入待测抗体各5 μL，鞘液洗涤2次，100 μL鞘液重悬即可上机检测。结果判定以膜抗原≥20%，胞质内抗原≥10%为阳性。

1.3.4多重巢式RT-PCR检测 ①细胞总RNA提取：分离患者骨髓的单个核细胞，采用血液总RNA提取试剂盒(天根，货号：DP433)提取总RNA，并通过微量紫外分光光度仪测定RNA浓度及纯度。②逆转录反应：反应体系20 μL，含Oligo dT18 Primer、逆转录缓冲液、dNTP、RNasin、MMLV 逆转录酶。42 ℃、1 h, 70 ℃、5 min逆转录反应合成cDNA。③PCR扩增：采用融合基因筛查试剂盒(北京思尔成公司，货号：F103)进行多重巢式PCR。第1轮扩增条件：95 ℃、5 min；95 ℃、30 s，59 ℃、1 min，72 ℃、1 min，共25个循环；72 ℃、8 min。第2轮扩增条件：95 ℃、5 min；95 ℃、30 s，59 ℃、1 min，72 ℃、1 min，共29个循环；72 ℃、8 min。④PCR 产物电泳：取第2轮PCR产物，在2%琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统观察结果并拍照。

2结果

2.1FAB分型102例白血病患者按FAB分型诊断为ALL 51例，其中L17例，L237例，L37例；AML 45例，其中M11例，M214例，M310例，M46例，M514例；UAL 6例。

2.2白血病流式细胞学免疫分型102例白血病中根据免疫分型诊断为B-ALL共38例，T-ALL共15例，AML共45例。6例FAB无法确诊的UAL经流式免疫分型后诊断为ALL(B /T细胞系)3例，其中急性混合型白血病(髓系/B细胞系)1例，B-ALL 2例；其余96例患者与流式分型结果一致，诊断为B-ALL 36例，T-ALL 15例，AML 45例。38例B-ALL主要表达抗原依次为cCD79a(89.5%，34/38)、CD19(86.8%，33/38)、CD10(78.9%，30/38)、CD22(76.3%，29/38)，非特异性早期标志抗原HLA-DR(73.7%，28/38)表达率较高。B-ALL交叉表达 CD33有10例(26.3%，10/38)，CD2有2例(5.3%，2/38)，CD5有2例(5.3%，2/38)。15例T-ALL患者最敏感的指标为cCD3(80.0%，12/15)、CD7(80.0%，12/15)，其次为CD2(73.3%，11/15)、CD5(66.7%，10/15)。T-ALL有4例 CD10(26.7%，4/15)、2例CD33(13.3%，2/15)交叉表达。45例AML患者中，以CD33、cMPO、CD117表达高，分别为97.8%(44/45)、84.4%(38/45)、73.3%(33/45)。AML中交叉表达 CD7有3例(6.7%，3/45 )、CD19有3例(6.7%，3/45)。

2.3多重巢式RT-PCR检测白血病相关融合基因102例急性白血病患者检出融合基因36例，总检出率为35.3%。在56例急性淋巴细胞白血病患者中检出融合基因21例，总检出率为37.5%，包括TLS/ERG、TEL/AML1、E2A/PBX1、MLL/AF9、MLL/AF4、BCR/ABL6种融合基因，分别为3、6、4、2、1、5例，各占14.3%、28.6%、19.0%、9.5%、4.8%、23.8%。 8例ALL-L3未检出融合基因。在45例急性髓细胞白血病患者中, 检出融合基因14例，总检出率为31.1%，包括PML/RARα、CBFβ/MYH11、AML1/ETO、MLL/AF9 4种融合基因，分别为7、4、1、2例，各占50.0%、28.6%、7.1%、14.3%。此外，1例急性混合型白血病检出TLS/ERG融合基因。

3讨论

白血病是造血组织的原发恶性疾病，具有生物学的异质性、分化程度的差异性和细胞形态的多形性等特点，其诊断需进行明确分型[2]。伴随科学技术的不断发展，白血病的分型得到不断完善，从最初的FAB分型，到最新的MICM分型。本研究对102例急性白血病进行FAB分型、免疫分型及分子生物学特性的联合分析。按FAB分型诊断ALL 51例，AML 45例，UAL 6例。传统FAB分型诊断的ALL和AML与免疫分型基本一致，6例UAL根据流式免疫分型可以明确诊断为2例B-ALL、3例ALL(B /T细胞系)、1例急性混合型白血病(髓系/B细胞系)。因此，根据免疫分型诊断ALL 56例，其中B-ALL共38例，T-ALL 15例，B /T细胞系3例；AML45例；髓系/B细胞系1例。

CD13、CD33具有骨髓相对特异性；MPO为中性粒细胞内嗜苯胺蓝颗粒的主要成分，其蛋白于早幼粒阶段开始合成，MPO是髓系特异性标志[3]。有研究[4]表明CD117是髓系较特异的表面标志，可作为辅助诊断AML的标志抗原。本研究发现，AML患者M1～M5各亚型广泛表达CD33(97.8%)、CD117(73.3%)和胞质内抗原cMPO(84.4% )，但特异性有所差异。CD33在B-ALL、T-ALL中有交叉表达，表达率为26.3%、13.3% 。而 CD117(5.3%、6.7%)和 cMPO(5.3%，0% )交叉表达少见，特异性较好。在较多文献[5，6]中还报道了AML患者高表达CD13，但在本次研究中CD13的表达率仅为31.1%，并且6例M4无1例表达。

B淋巴系最常见的抗原有cCD79、CD19、CD10、CD20、CD22。cCD79a是B淋巴系的特异性标志，只表达与胞质内，不表达于细胞膜。有文献[7]报道CD10对预后判断具有提示作用，通常CD10阳性B-ALL患者预后较好。本研究中cCD79a在B-ALL中高表达(89.5%)，在AML中偶有表达(4.4%)，在T-ALL中无表达。CD19(86.8%、CD10(78.9%)、CD22(76.3%)在 B-ALL中常见表达，CD20敏感性较差，表达率只有36.8%。cCD3抗原是T淋巴细胞的特异性标志，其在胞质内的出现早于细胞膜，因此检测胞质内敏感性强于胞膜。T-ALL中cCD3(80.0%)、CD7(80%)、CD2(73.3%)和CD5(66.7%)的敏感性及特异性均较高，在AML和B-ALL中表达极低。

多数白血病遗传学异常与形态学的关系尚无明确关系，但已发现某些融合基因在FAB分型中具有特定的分布特点[8]。PML/RARα融合基因由t(15;17)(q22；q21)染色体异位形成，主要见于AML-M3。本研究所检出的7例均出现于M3患者。CBFβ/MYH11融合基因由inv(16)(p13；q22)及t(16；16)(p13；q22)染色体异位形成，主要见于M4，也见于部分M5，少数见于M2。检出的4例CBFβ/MYH11融合基因出现于3例M4和1例M2患者。TEL/AML1融合基因是儿童急性淋巴细胞白血病中最常见的染色体结构异常，常见于25%的儿童B-ALL患者，患者对治疗反应佳，完全缓解时间长，预后好。本研究检出的6例阳性表达患者均为儿童，年龄4～15岁，免疫分型显示均为B-ALL。E2A/PBX融合基因主要见于3%～5%儿童和3%的成人ALL患者，约占儿童前驱B细胞ALL患者的25%。本研究检测出的4例阳性表达患者均为儿童前驱B细胞ALL患者。检出的5例BCR/ABL阳性患者经免疫分型分析为B-ALL患者，与报道[9]相一致。此外，TLS-ERG与MLL/AF9两种融合基因在ALL和AML患者中均出现。

本研究以FAB分型为基础，应用流式细胞术的免疫分型，采用单克隆抗体对白血病的细胞来源和分化阶段进行更精细的检测，从而提高了白血病诊断的准确率，弥补了FAB分型的不足。再联合分子生物学检测，以其灵敏、快速、准确的特点，使白血病分型更为精确、客观，为临床诊断、预后及治疗方案的选择提供更为可靠的依据。

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(收稿日期：2014-08-29)