异种胰岛移植的临床前期研究进展

徐 均，邓绍平

(1.川北医学院，四川 南充 637000；2.四川省医学科学院·四川省人民医院肝胆外科细胞移植中心，四川 成都 610072)

异种胰岛移植的临床前期研究进展

徐 均，邓绍平

(1.川北医学院，四川 南充 637000；2.四川省医学科学院·四川省人民医院肝胆外科细胞移植中心，四川 成都 610072)

随着对糖尿病治疗方法的研究进展，异种胰岛移植已被重新认识。笔者综述异种胰岛移植的异种胰岛来源、胰岛移植物的制备及鉴定、主要的免疫排斥反应及其防治措施。

胰岛移植；异种；糖尿病/外科学

胰岛移植不仅能逆转糖尿病动物的高血糖状态，而且能防止糖尿病慢性并发症的发生、发展。但供体的严重短缺极大阻碍了临床胰岛移植的发展。胰岛细胞移植重建胰岛的分泌系统[1]，已被确认是唯一一种彻底根治糖尿病的治疗方法[2]。然而同种异体胰岛细胞移植受到限制，无法满足广大糖尿病患者的需要。目前异种胰岛移植已成为移植界一个新的研究热点，对移植物进行移植前处理，可以降低移植物免疫原性、提高抗免疫能力、增强胰岛细胞功能和扩大移植物数量。本文就异种胰岛移植供体选择、移植部位的选择、胰岛细胞的功能活性、移植物的制备与纯化、移植后排斥反应与防治措施等方面的进展作一综述。

1 移植供体的选择

对异种移植而言，用作异种移植供体的动物不仅要求是转基因动物，更要求是纯系动物。1996年，我国国家科委“863”计划立项开展转人DAF基因和α2 gT基因猪研究，揭开了我国开发异种供体源的序幕。1997年，国家自然科学基金委员会将猪 →人异种移植基础研究列为重大攻关项目，现正在加紧实施。猪易于饲养繁殖，一胎多生，成熟周期短，数量多，繁殖特性使人们可以有效地培育其近交系，具备在洁净环境下大量培育遗传工程供体等优点。由于猪与人的胰岛素结构较为接近，且猪胰岛素已成功地应用于临床达数十年之久，充分证明其纠正糖尿病高血糖状态的安全性和有效性，故成为临床异种胰岛移植中最有希望的动物供体来源之一[3，4]。

2 移植部位的选择

选择合适的移植部位对植入胰岛的存活、防止排斥均有重要影响[5]，胰岛移植的部位主要为门静脉、肾被膜下、皮下、肌肉、脾、胰腺、腹膜、网膜囊、胃肠壁、睾丸、胸腺、骨髓、眼前房和脑室等[6～8]。目前，国内外对胰岛理想移植部位的认识不一。1972 年，Ballinger 等首次报道将分离的大鼠胰岛细胞400～ 600 个经腹腔移植给糖尿病大鼠，成功地逆转了糖尿病。1973 年，Kemp 等[9]比较了经门静脉与经腹腔移植胰岛细胞的存活与功能的差异性，即移植部位的不同将影响胰岛细胞的生存与功能的发挥。随后，探索胰岛细胞移植的理想部位也得到广泛研究，如经脾静脉移植胰岛、或经肌肉移植胰岛、或经腹腔移植胰岛等分别在狗和猴的糖尿病模型中得到研究。多数结果表明，经门静脉移植的胰岛细胞停留在肝内的存活率与功能均优于其他的移植部位，是目前胰岛细胞移植的首选部位[10]。

3 猪胰岛细胞的制备与纯化

3.1 胰岛细胞的制备 自1990年Ricordi发明自动化消化技术以来，胶原酶灌注消化法[11]成为国际上流行的一种胰岛细胞分离方法。近年也有学者采用手工的静态两步消化法分离猪胰岛：首先将用胶原酶液膨胀的胰腺放在冰水(冷消化)，然后不加振动在37 ℃水槽里孵育消化(热消化)，也取得了较高的胰岛产量。胎猪与新生猪胰腺所含的外分泌组织较少，一般采用剪碎加酶消化胰腺组织法。成年猪胰腺结缔组织较多，故而胰岛细胞的分离提取相对较难，方法也多种多样，但基本上还是采用Ricordi等所确立的分离模式。

3.2 胰岛细胞的纯化 成年猪胰岛细胞分离后需经过纯化方可移植。间断密度梯度离心是常用的纯化方法，可用作梯度介质的物质有：聚蔗糖(Ficoll)、Dextran、Perc011、Nycodez和蔗糖等[12～14]。目前主要是采用Ficoll作为密度分离介质来纯化胰岛，但其含有的内毒素可能对细胞功能有较大的不良影响，因而并不适用于临床移植实验。碘克沙醇(Iodixanol)作为临床上广泛使用的造影剂，具有低内毒素、等渗透压、对细胞损伤少等优点。本研究小组的实验结果表明[15]，与Ficoll-400分离液相比，Iodixanol混合液可显著提高成年猪胰岛细胞的产量、活性及胰岛素的分泌，可成为Ficoll分离液纯化的替代方案。近年来，随着半自动与自动分离法的出现，进一步提高了胰岛收获量，达160000～440000 IEQ，为开展前期临床实验奠定了坚实的基础。

4 胰岛细胞的功能活性鉴定

胰岛细胞的功能活性目前常用以下几种方法测定：①组织形态学染色。目前最常使用的是双硫腙(DTZ)法。②体外葡萄糖刺激胰岛素分泌试验。分为静止态刺激试验和灌注法。即通过测定胰岛细胞在不同浓度葡萄糖环境中分泌胰岛素的能力及环境中的葡萄糖水平，以判断胰岛细胞的活性。③胰岛组织培养液中胰岛素含量测定。可采用放射性免疫法或酶联免疫法。④荧光染色。采用叮啶橙(acridine orange，AO)和碘丙啶(propidium iodide，PI) 染色，荧光镜下观察，活细胞染成绿色，死细胞染红色；可以鉴别活性与无活性胰岛。⑤动物实验。将分离纯化后的胰岛细胞移植于糖尿病动物模型体内，观察其逆转高血糖状态的能力[16～18]。目前常用的方法缺乏特异性。几种新的技术手段仍在探索中，如测定胰岛的氧耗率(oxygen consumption rate，OCR)、ATP/ADP比率、ATP/DNA 比率[19]等反映其胰岛细胞线粒体膜的完整性和功能。因此，目前对胰岛细胞质量的评估和移植预后的判断在一定程度上仍依赖实践经验的积累。

5 移植后的排斥反应防治

组织或细胞移植(如胰岛移植) 的主要障碍之一是移植排异反应，解决这个问题的方法之一是使用免疫抑制剂，但这会使患者处于免疫力低下风险中；另一种解决方法是免疫隔离及免疫耐受。

5.1 免疫隔离 克服免疫排斥反应是细胞移植治疗的关键问题。作为免疫隔离屏障的微囊为克服细胞移植治疗疾病研究中的免疫排斥反应和移植物来源稀少问题提供了新的途径。微囊壁是半通透性的膜结构，只允许小分子物质(包括囊外营养物质和囊内细胞代谢产物) 自由通过，这样可维持移植物长期存活避免免疫细胞和抗体攻击。微囊材料的主要作用是为移植物提供免疫保护环境，因而膜材料化学成分将直接影响微囊的生物相容性和物理稳定性。膜材料主要有藻酸盐多聚赖氨酸、琼脂糖、脱乙酞己丁质、聚丙烯胺及轻甲基纤维素钠等。目前以海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微囊技术发展最为成熟。APA 具有较低的细胞毒性和较好的细胞豁附性、长期的稳定性和较高的生物相容性等优点。鉴于APA微囊仍然存在膜脆性强、难处理、高成本以及PLL的免疫原性和细胞毒性等缺点，最新的研究采用了可以提高微囊大小一致性及其稳定性，增加囊壁厚的聚亚甲基二肌氯化氢(poly methylene co guanidine，PMCG)来代替聚赖氨酸(PLL)。研究证明，海藻酸钠-聚亚甲基二肌·氯化氢-海藻酸钠(alginate PMeo-alginate，A-PMCG-A)微囊比目前最常用的APA微囊强度更高，同时可以提供给细胞更充分更妥当的微环境。微囊化胰岛移植目前仍处于实验阶段，主要原因是移植物免疫排斥反应和微囊异物反应所致的纤维组织过度生长，这种纤维化将胰岛和周围环境隔离，影响微囊半透膜的通透性，导致胰岛难以摄取氧气和营养物质，胰岛因缺氧而死。

5.2 免疫耐受 虽然在小动物实验研究及个别灵长类动物中已成功诱导了免疫耐受，但同样的诱导方案却难以在临床得以实现。基于排斥反应和耐受形成机理，人们探索了多种诱导方法。

5.2.1 外周性耐受 免疫耐受研究早期常应用单克隆抗体(mAb)来阻断T 细胞表面分子，如OKT3 针对T 细胞表面的CD3 分子，降低TCR 的表达；或利用抗CD4/ CD8-mAb 来清除循环中活化T细胞[20]，目前已开发了抗LFA-1 mAb 和ICAM-1 mAb，利用2个mAb 可阻断T 细胞和抗原递呈细胞(APCs)间的结合，减轻对移植物血管内皮细胞的损伤，减少血管并发症的发生率。阻断T 细胞活化的第一信号利用TCR 特异性抗体来阻断TCR与MHC/抗原肽的结合，使T 细胞活化缺乏第一信号，从理论上来讲是一种有效的方法[21～ 23]。但这种抗体只能针对某一特殊亚群TCR 的T 细胞，而无法完全阻断参与抗原识别的所有T细胞，从而限制了其临床应用。阻断T细胞活化的第2信号目前已有多条共刺激通路为人们所认识，如B7-1/ B7-2-CD28、CD40/ CD40L(CD154，gp39)、诱导型共刺激分子(ICOS)等，其中前2种研究最多。利用抗-CD40/CD40L mAb 和细胞毒性T 细胞相关抗原4免疫球蛋白(CT LA4-Ig)等阻断剂来阻断上述信号通路使T细胞缺乏第2信号而无能，从而诱导供体特异性耐受是近年来研究最为活跃的领域[24，25]。但这些单抗在体内半衰期短，不能长久发挥作用，因此人们又利用转基因技术将表达CTLA4-Ig 和CD40-Ig 或CD40L-Ig 的重组腺病毒导入体内，使其持续生成，有效地预防急、慢性排斥反应，诱导移植物耐受。

5.2.2 中枢耐受 中枢性耐受中目前研究较广的为嵌合体形成诱导耐受。1993年，Starzl等[26]在长期存活的肾移植受者体内发现了供体来源的异基因细胞，认为它对移植物的长期存活很关键，把这种供、受体细胞共存、相互耐受的现象称为“ 嵌合(chimerism)”。移植前人为输注供体抗原，待受体建立异基因嵌合体并诱导特异性免疫耐受后再行目标器官移植，使移植物“逃逸” 免疫损伤。目前，供体特异性骨髓细胞(dono r-specificbone marrow cells，DBMC)输注已成为研究诱导移植免疫耐受的热点。虽然大量的基础实验和临床数据资料已证实DBMC 输注可建立异基因嵌合体，可能成为最接近临床的方法，但当中也存在着许多争论与尚无法解决的问题，如何把握DBMC 输注方式、骨髓源的获取，如何加深耐受状态并长期维持嵌合状态将是下一步研究的重点。

6 结论

异种移植治疗糖尿病现已显示出广阔的应用前景[27，28]，但如何获取大量高质量的功能性胰岛细胞及有效地抑制异种免疫排斥反应的发生，仍是异种胰岛移植所面临的主要问题[29，30]。

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