敦煌疗风虚瘦弱方对小鼠急性缺氧的保护及抗休克作用

2015-04-05杜丽东妥海燕蔺兴遥李金田吴国泰

中医研究 2015年4期

关键词：丹参片存活空白对照

李芳，杜丽东，妥海燕，蔺兴遥，李金田，吴国泰

(甘肃中医学院敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室<培育基地>，甘肃兰州 730000)

·实验研究·

敦煌疗风虚瘦弱方对小鼠急性缺氧的保护及抗休克作用

李芳，杜丽东，妥海燕，蔺兴遥，李金田，吴国泰

(甘肃中医学院敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室<培育基地>，甘肃兰州 730000)

目的：观察敦煌疗风虚瘦弱方(以下简称LXT)对小鼠急性缺氧的保护及抗休克作用。方法:观察小鼠常压缺氧条件下的存活时间；用异丙肾上腺素致小鼠急性心肌缺氧，观察其平均存活时间；用脂多糖(LPS)致小鼠感染性休克，观察其存活时间并计算造模后24h、48h、72h的死亡率；分别用静脉快速推注饱和氯化镁溶液和断头方法观察LXT对小鼠急性脑缺血缺氧的影响。结果:与空白对照组对比，LXT高剂量(120g生药/kg体质量)、中剂量(60g生药/kg体质量)能明显延长小鼠常压缺氧存活时间(P<0.05，P<0.01)。与模型对照组对比，LXT高、中剂量均能延长异丙肾上腺素致急性心肌缺氧模型小鼠的平均存活时间(P<0.05，P<0.01)。LXT高剂量对内毒素诱导的小鼠休克在24h内有一定的保护作用(P<0.05)。LXT高、中剂量能延长饱和氯化镁致急性脑缺血小鼠的存活时间(P<0.05)；LXT高剂量能延长急性断头小鼠的存活时间，增加张口次数(P<0.05)。结论:LXT对小鼠急性缺氧有一定的保护作用，对内毒素诱导休克小鼠具有一定的保护作用。

敦煌疗风虚瘦弱方/药物作用；缺血缺氧/药效学；内毒素休克/药效学；存活时间；动物模型；小鼠

敦煌疗风虚瘦弱方(以下简称LXT)是由《金匮要略》中当归生姜羊肉汤、黄芪桂枝五物汤、黄芪建中汤化裁而成,与《备急千金要方》所载内补当归建中汤、羊肉汤的主治及组成有相似之处，有益气调血、散寒化瘀、化湿通络的功效[1]。该方具备对抗缺氧和提高机体抗应激刺激的理论基础[2-4]，但是有关其抗缺氧及抗休克方面的研究未见报道。本研究观察LXT对小鼠急性缺氧的保护及抗休克作用，以期为LXT的进一步研究和开发提供实验依据。

1 材料

1.1 动物

昆明种小鼠320只，体质量18～22g，雌雄兼用，由甘肃中医学院实验动物中心提供，合格证号SCXK(甘)2011-0004。喂饲标准饲料(由甘肃中医学院实验动物中心提供)，饲养温度(20±2)℃，相对湿度30%～50%，适应3d后开始实验。

1.2 药品、试剂与仪器

敦煌疗风虚瘦弱方(LXT)受试物，自制，药物组成：当归、生姜各60g，黄芪、芍药、川芎各45g，桂心、甘草各30g，羌活15g，干枣30枚(擘破)，羊精肉1 500g。以水3 500mL，先煮肉1h；去肉取汁2 500mL，下诸药，加水1 000mL，复煎1h；取汁2 500mL，浓缩得质量分数为172g/L的混悬液。复方丹参片，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂产品，批号11021185；盐酸异丙肾上腺素注射液，上海乐丰制药厂产品，批号31021344；盐酸普萘洛尔片，东北制药集团沈阳第一制药有限公司产品，批号21021826；地塞米松片，浙江仙琚制药股份有限公司产品，批号20120733；脂多糖，美国Sigma公司产品，批号137F05601；无水氯化镁，天津市福晨化学试剂厂产品，批号20120820；BSA224S型电子天平，德国Sartorius公司产品；Morris水迷宫，成都泰盟科技有限公司产品。

2 方法与结果

2.1 统计学方法

2.2LXT对小鼠常压耐缺氧时间的影响

参照文献方法[5-6]。取小鼠50只，随机分为空白对照组、复方丹参片组和LXT高、中、低剂量组5组，每组10只，依次灌胃生理盐水、复方丹参片0.39g/kg体质量(相当于临床70kg成人日用量的10倍)和LXT120，60，30g/kg体质量(分别相当于临床70kg成人日用量的20，10，5倍)，给药容量20μL/g，1d1次，连续3d。末次给药60min后分别将每只小鼠置于底部预先放有50g新鲜钠石灰的300mL广口瓶中，加盖密封，立即计时，观察并记录各小鼠的存活时间。以呼吸停止、翻正反射消失为死亡指征。

结果见表1。与空白对照组对比，LXT高、中剂量组和复方丹参片组小鼠存活时间延长，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

表1 各组小鼠常压耐缺氧时间对比

组别剂量/(g·kg-1)常压耐缺氧时间/min空白对照组—13．88±2．16复方丹参片组0．3915．86±1．55LXT高剂量组12017．51±2．53∗∗LXT中剂量组6016．14±1．64∗LXT低剂量组3014．21±2．27

注：与空白对照组对比，* P<0.05，** P<0.01。

2.3LXT对异丙肾上腺素致急性心肌缺氧小鼠存活时间的影响

参照文献方法[7-8]。取小鼠60只，随机分为空白对照组、模型对照组、盐酸普萘洛尔组和LXT高、中、低剂量组6组，每组10只。LXT高、中、低剂量组分别灌胃LXT120，60，30g/kg体质量(分别相当于临床70kg成人日用量的20，10，5倍)，盐酸普萘洛尔组灌胃盐酸普萘洛尔20μg/g体质量(相当于临床70kg成人日用量的10倍)，空白对照组和模型对照组灌胃同体积的生理盐水，给药容量20μL/g，1d1次，连续3d。末次给药30min后，除空白对照组外，其他各组小鼠均腹腔注射盐酸异丙肾上腺素15μg/g，30min后，分别将每只小鼠放入底部预先放有50g新鲜钠石灰的300mL广口瓶中，加盖密封，立即计时，观察并记录各小鼠的存活时间。以呼吸停止、翻正反射消失为死亡指征。

结果见表2。与空白对照组对比，模型对照组小鼠存活时间缩短，差别有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组对比，LXT高、中剂量组和盐酸普萘洛尔组小鼠存活时间延长，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。LXT高、中剂量组存活时间与盐酸普萘洛尔组对比，差别无统计学意义。

表2 各组小鼠存活时间对比

组别剂量/(g·kg-1)存活时间/min空白对照组—14．39±3．04模型对照组—13．53±2．25∗盐酸普萘洛尔组0．0216．95±4．85##LXT高剂量组12016．52±4．59#LXT中剂量组6016．41±3．74##LXT低剂量组3014．86±4．92

注：与空白对照组对比，* P<0.05，** P<0.01；与模型对照组对比，# P<0.05，## P<0.01。

2.4LXT对内毒素休克小鼠的保护作用

参照文献方法[9-10]。取小鼠60只，随机分为空白对照组，模型对照组，地塞米松组和LXT高、中、低剂量组6组，每组10只。LXT高、中、低剂量组分别灌胃LXT120，60，30g/kg体质量(分别相当于临床70kg成人日用量的20，10，5倍)，地塞米松组灌胃地塞米松30μg/g(相当于临床70kg成人日用量的10倍)，空白对照组和模型对照组灌胃同体积生理盐水，给药容量为20μL/g，1d1次，连续3d。末次给药前30min，除空白对照组以外，其他各组小鼠均腹腔注射LPS60μg/g，30min后，给药1次。立即计时，观察并记录每只小鼠的生存时间并计算24h、48h、72h死亡率。

结果见表3。模型对照组小鼠造模72h后的死亡率是100%，说明内毒素诱导休克小鼠模型成功。在造模后24h，LXT高、中、低剂量组死亡率有不同程度地降低，其中LXT高剂量组较模型对照组差别有统计学意义(P<0.05)。在造模后48h和72h，LXT高、中、低剂量组死亡率亦有降低，但组间差别无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组小鼠死亡率对比

组别剂量/(g·kg-1)死亡率/%24h48h72h空白对照组—000模型对照组—100100100地塞米松组组0．03000LXT高剂量组12060#7070LXT中剂量组60708080LXT低剂量组3070100100

注：与模型对照组对比，#P<0.05。

2.5LXT对小鼠脑缺血、缺氧的影响[11-13]

2.5.1LXT对饱和氯化镁致小鼠急性脑缺血的影响

取小鼠50只，随机分为空白对照组，复方丹参片组和LXT高、中、低剂量组5组，每组10只。LXT高、中、低剂量组分别灌胃LXT120，60，30g/kg体质量(分别相当于临床70kg成人日用量的20，10，5倍)，复方丹参片组灌胃复方丹参片0.39g/kg体质量(相当于临床70kg成人日用量的10倍)，空白对照组灌胃同体积生理盐水，给药容量为20μL/g，1d1次，连续3d。各组小鼠末次给药30min后，于尾静脉快速推注饱和氯化镁溶液(350g/L)造成急性脑缺血模型。记录从尾静脉注射开始小鼠反射性张口喘气至最后一次的张口时间。

结果见表4。与空白对照组对比，LXT高、中剂量组和复方丹参片组小鼠存活时间延长，差别有统计学意义(P<0.05)。

表4 各组小鼠存活时间对比

组别剂量/(g·kg-1)存活时间/s空白对照组—24．12±1．88复方丹参片组0．3927．41±3．71∗LXT高剂量组12026．88±3．31∗LXT中剂量组6026．21±1．93∗LXT低剂量组3026．25±4．25

注：与空白对照组对比，* P<0.05.

2.5.2LXT对小鼠急性断头张口的影响

分组及给药方法同2.5.1。各小鼠末次给药30min后，用锋利剪刀沿小鼠耳后将其头部迅速剪下，立即计时，观察断头后各小鼠张口次数及断头后至最后一次张口的时间。

结果见表5。与空白对照组对比，LXT高剂量组和复方丹参片组小鼠存活时间延长，张口次数增加，差别有统计学意义(P<0.05)。

表5 各组小鼠断头存活时间和张口次数对比

组别剂量/(g·kg-1)存活时间/s张口次数/次空白对照组—16．59±3．2811．37±4．73复方丹参片组0．3919．93±2．93∗14．67±2．50∗LXT高剂量组12019．32±1．66∗14．15±2．52∗LXT中剂量组6019．98±3．7014．00±2．14LXT低剂量组3017．14±5．3513．87±2．28

注：与空白对照组比较，* P<0.05。

3 讨论

缺氧是由于各种原因使机体组织得不到充足的氧或不能充分利用氧,引起机体代谢、机能甚至形态结构发生异常变化,是临床各科多种疾病和死亡的重要、常见的直接因素或主要病理过程之一。中药和中药复方具有多组分、多途径、多靶点、有时序性的整合调节作用，在抗缺氧方面具有独特优势。敦煌疗风虚瘦弱方具有益气养血、解表散寒之功效。方中桂心、羌活解表散寒，温通阳气；生姜、大枣升腾脾胃升发之气，使气血化源充足；当归、川芎、芍药养血调血；黄芪、甘草益气调中；精羊肉大补精血虚寒。诸药合用，则诸症自愈。

建立缺氧动物模型并观察药物对模型动物的作用是寻找和发现抗缺氧药物、探索有效治疗手段的重要途径。常压缺氧模型是将小鼠放入装有钠石灰的广口瓶内，用凡士林密闭瓶盖；由于小鼠呼吸消耗O2，而呼出的CO2又被钠石灰吸收，密闭容器内气体不断减少，氧分压不断下降，造成小鼠缺氧。此方法属于物理缺氧模型，操作简单易行，被广泛使用。异丙肾上腺素腹腔注射可以增加心肌耗氧量，加速小鼠耗氧速度，缩短存活时间，降低氧利用能力。此为化学药物缺氧模型。断头缺氧模型是采用断头法中断脑供血、供氧来制备急性完全脑缺氧模型。断头后在短时间内脑中原有的血液和营养物质可使脑功能维持短暂时间，小鼠显示出有规律的张口喘气。尾静脉注射饱和氯化镁可使小鼠心脏发生窦性心动过缓、传导阻滞，还可抑制呼吸中枢，使呼吸肌麻痹引起死亡，脑供血停止，从而造成急性脑缺氧模型。本研究建立了上述物理、化学和机体损伤缺氧模型，观察并记录LXT不同剂量对缺氧动物的存活时间的影响，从多角度研究证实LXT的抗缺氧作用。研究结果显示：LXT高、中剂量能明显延长小鼠常压缺氧和化学药物异丙肾上腺素引起缺氧模型小鼠的平均存活时间；LXT对急性脑缺血缺氧有一定的保护作用，LXT高、中剂量能显著延长饱和氯化镁致小鼠急性脑缺血小鼠的存活时间，LXT高剂量能延长急性断头小鼠的存活时间，增加张口次数。

脂多糖是内毒素的主要化学成分，可激活单核-巨噬细胞系统，释放TNF-α等许多细胞因子和炎症介质，导致细胞、组织、器官损伤，从而引起实验动物休克。本实验中，LXT高、中、低剂量组的死亡率有不同程度地降低，但是与模型对照组对比，差别无统计学意义。

LXT对小鼠急性缺氧的保护作用和降低脂多糖所致休克小鼠死亡率的作用机制还有待进一步研究。

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