稳定高表达CYP2E1基因肝癌HepG2细胞系的构建
2015-04-04熊永福闫再华杨召李敬东川北医学院四川南充637007川北医学院附属医院
熊永福,闫再华,杨召,李敬东(川北医学院,四川南充 637007;川北医学院附属医院)
稳定高表达CYP2E1基因肝癌HepG2细胞系的构建
熊永福1,闫再华1,杨召1,李敬东2(1川北医学院,四川南充 637007;2川北医学院附属医院)
摘要:目的 构建稳定高表达CYP2E1基因的肝癌HepG2细胞系。方法通过NCBI查询CYP2E1的编码序列,设计并构建表达质粒pLV(Exp)-Puro-CMVm-CYP2E1,用载体对应的慢病毒包装质粒(pMDLg/pRRE、pRSV-REV和pMD2.G)共同转染293T细胞。利用携带CYP2E1基因的慢病毒(Lenti-CYP2E1-eGFP-Puro)感染HepG2细胞系,采用嘌呤霉素抗性筛选方法构建高表达CYP2E1肝癌HepG2细胞系。增强绿色荧光蛋白检测转染情况,荧光定量PCR及Western blotting检测HepG2、空载及转染CYP2E1基因的HepG2细胞系中CYP2E1 mRNA和蛋白。结果HepG2细胞系均成功转染CYP2E1基因。HepG2、空载及转染CYP2E1基因的HepG2细胞系中CYP2E1 mRNA相对表达量分别为1.02±0.06、1.06±0.05、7.42±0.07,蛋白相对表达量分别为0.26±0.02、0.29±0.01、1.61±0.08,转染CYP2E1基因的HepG2细胞系与前两者比较,P均<0.05。结论通过慢病毒转染成功构建了稳定高表达CYP2E1基因的肝癌HepG2细胞系。
关键词:CYP2E1基因;慢病毒载体;肝癌;HepG2细胞
原发性肝癌是临床常见的高致命性癌症。美国癌症中心数据显示2014年全美新增肝胆癌患者33 190例,占所有新增肿瘤患者的2.0%。近10年肝癌发病率以每年4.2%的速度递增。虽然影像检查与外科技术的迅猛发展使得大部分肝癌患者可以接受手术治疗,也使其5年生存率由3.0%提高到了16.8%[1]。但由于该病起病隐匿、进展迅速、易转移复发,病死率依然高居恶性肿瘤第2位[2]。因此,研究肝癌的复发转移机制,寻找关键信号通路作为治疗靶点,从而提出新的防治措施是当务之急。细胞色素P450 2E1(CYP2E1)是肝脏的重要代谢酶,参与肝病和肝细胞癌的发生发展,并可通过增加花生四烯酸(AA)等环节参与肝癌侵袭转移[3]。对CYP2E1的研究有助于寻找治疗肝癌的新靶点。本研究旨在通过慢病毒载体在HepG2细胞系中实现CYP2E1基因的持续稳定高表达,为深入研究CYP2E1在肝癌发生发展中的作用及分子机制奠定基础。
1材料与方法
1.1主要试剂、质粒和细胞人肝癌HepG2细胞系、慢病毒载体pLVX及包装质粒pMDLg/pRRE、pRSV-REV和pMD2.G由阿尔伯特·爱因斯坦医学院宗海红教授惠赠;大肠杆菌DH5α细胞由川北医学院风湿免疫研究所惠赠;人正常肝细胞L02细胞系由川北医学院肝胆胰肠研究所保存;用于慢病毒包装的293T细胞株购自ATCC公司(USA);TRIzol RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司(USA);质粒小量提取和无内毒素质粒中量提取试剂盒购自美国Omega Bio-Tek公司;ImProm-ⅡTM逆转录试剂盒购自Promega公司(USA);胎牛血清及各种培养液分别购自Hyclone公司和Sigma公司(USA);CYP2E1抗体(Anti-Cytochrome P450 2E1 antibody)购自英国ABCAM公司。
1.2细胞培养HepG2细胞系、L02细胞系培养于加入10%小牛血清(Gibco,USA)的DMEM(Hyclone,USA)培养基中。细胞均常规培养于37 ℃、5%CO2的恒温培养箱内[4]。
1.3CYP2E1基因慢病毒转染HepG2细胞系查询CYP2E1的编码序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),通过NEBcutter V2.0(http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php)检测序列的特异性核酸内切酶位点。以L02中所获得的cDNA为模板,利用PlatinumRTaq高保真DNA聚合酶(Invitrogen,USA)通过PCR扩增得到带有XmaⅠ酶切位点的CYP2E1编码序列,将CYP2E1序列连接入pLVX[pLV(Exp)-Puro-CMVm-CYP2E1]的相应位点之间得到重组质粒pLVX,转入DH5α感受态细胞,进行阳性克隆筛选并经测序(Invitrogen公司)证实。扩增并收集测序正确的重组质粒pLVX载体,用pLVX载体对应的慢病毒包装质粒(pMDLg/pRRE、pRSV-REV和pMD2.G)共同转染293T细胞。将加入上述质粒共培养的293T细胞置于37 ℃、5%CO2的恒温培养箱内。48 h后吸取培养基并用0.45 μm滤膜过滤,收集病毒上清。使用Lenti-X GoStix试剂盒测定病毒滴度。编号后将病毒上清保存于-80 ℃冰箱。将没有插入CYP2E1基因片段的载体作为空载对照。取生长状态良好的HepG2,消化后细胞计数板计数。按1×105/瓶的HepG2细胞接种于25 cm2的培养瓶中。置于37 ℃、5%CO2的恒温培养箱内12 h,待细胞全部贴壁,铺板到50%左右。预先37 ℃水浴解冻携带CYP2E1基因的慢病毒(Lenti-CYP2E1-eGFP-Puro)病毒上清,用含10% FBS的DMEM培养基对半稀释,加入人嘌呤霉素至终浓度为6 μg/mL。吸出原瓶中培养基,PBS漂洗2次,加入上述含病毒培养基培养。24 h后换正常的DMEM完全培养基再培养24 h,同时将嘌呤霉素浓度调整至4 μg/mL对细胞进行筛选,2 d换液1次,筛选6 d。将没有插入CYP2E1基因片段的HepG2细胞系作为空载对照细胞。
1.4稳定高表达CYP2E1基因HepG2细胞系的鉴定
1.4.1CYP2E1检测采用增强绿色荧光蛋白(eGFP)测定。转染48 h后,荧光显微镜检测重组质粒pLVX中的绿色荧光蛋白eGFP表达情况,以证实eGFP-Puro-CYP2E1成功整合到HepG2细胞系基因组中,并表达eGFP蛋白。于转染后2、4、6 d分别检测荧光蛋白表达情况。经传代培养后冻存,3个月后复苏并于复苏后2、4、6 d观察荧光情况。
1.4.2CYP2E1 mRNA检测采用荧光定量PCR检测。分别接种HepG2、空载及转染CYP2E1基因的HepG2细胞系至6孔板(约1×105个),培养细胞约24 h,细胞密度达到80%左右。按照RNA提取试剂盒说明书,用RNeasy Mini Kit提取细胞总RNA,Nanodrop2000测定浓度及纯度。用PrimeSeript RT reagent Kit将总RNA反转录为cDNA。取上述3种细胞的cDNA各1 μL为模板进行荧光定量PCR,检测CYP2E1 mRNA的表达。
1.4.3CYP2E1蛋白检测取生长状态良好,细胞密度90%左右的正常HepG2、空载及转染CYP2E1基因的HepG2细胞系。吸弃培养基,冷PBS漂洗3遍,吸尽培养瓶(25 cm2)残液后加入200 μL细胞裂解液,冰上孵育3 min后用细胞刮迅速刮下,吸入500 μL EP管中,然后将EP管置于冰上继续裂解30 min,12 000 r/min、4 ℃离心15 min。取上清液采用BCA法测定蛋白浓度,然后加入5×SDS-PACE上样缓冲液,100 ℃变性5 min。每组样品取总蛋白60 μg,10%SDS-PACE电泳分离,然后电转至PVDF膜,5%脱脂奶粉(TBST溶解)室温封闭2 h,加入一抗,4 ℃孵育过夜(约12 h),第2天用TBST洗膜3次(每次10 min),再加入二抗,室温孵育1 h,TBST洗膜3次(每次10 min)后,加入Western blotting化学发光试剂后用GE冷CCD成像系统对其进行曝光拍照,所得图像用Image J软件进行条带灰度定量分析。以GAPDH为内参,检测三者CYP2E1蛋白表达水平。
2结果
eGFP-Puro-CYP2E1成功转入HepG2细胞系,并表达荧光蛋白。复苏后2、4、6 d所检测到的荧光强度有所减弱,但表达率仍接近100%。详见插页Ⅱ图5。HepG2、空载及转染CYP2E1基因的HepG2细胞系中CYP2E1 mRNA相对表达量分别为1.02±0.06、1.06±0.05、7.42±0.07,蛋白相对表达量分别为0.26±0.02、0.29±0.01、1.61±0.08,转染CYP2E1基因的HepG2细胞系与前两者比较,P均<0.05。
3讨论
基因过表达技术是通过不同途径将外源基因导入靶细胞,使其表达相应蛋白质,从而实现对基因(或蛋白质)功能的研究[5]。基因导入的基本方法主要有化学法、物理法和生物法。然而理化方法简单粗暴、转染效率低,对细胞损伤明显,且不能实现目的基因的持续稳定表达,局限了其应用范围[6]。而以慢病毒转染为代表的生物法,既可以提供高效的基因转染又可以实现长期稳定的基因表达。尤其是以Ⅰ型人类免疫缺损病毒(HIV-1)为代表的慢病毒[7,8]。但该方法步骤繁琐复杂,技术难度较大,具有潜在生物危害。本研究为构建持续稳定高表达CYP2E1基因的HepG2细胞系,实现真正的目的基因与自身遗传物质整合,减少外源基因对非基因相关特性的影响,最大限度保留HepG2自身生物学特性,采用了HIV-1为基础构建的慢病毒载体系统,这也是目前较为理想的基因转染载体[9,10]。
细胞色素P450为肝脏主要代谢酶,该酶系有100多种同工酶,CYP2E1约占其总量的7%。虽然CYP2E1不是药物的主要代谢酶,但参与环境致癌物代谢,在多种癌症易感性中起重要作用[11]。Caro等[12]研究证实:CYP2E1通过Ca2+-磷脂酶A2(PLA2)的激活加剧AA的产生并直接参与AA代谢,而AA在环氧合酶2(COX-2)的作用下转化前列腺素E2,后者导致EGFR/Met信号激活引起肝癌侵袭转移。CYP2E1作为代谢酶不仅通过其代谢过程中的各种底物与产物参与细胞功能调节,我们课题组的研究[13]还表明CYP2E1本身就能够促进肝癌转移复发。枯否细胞(KCs)约占肝脏细胞的15%,是最重要的肝癌相关巨噬细胞。我们的研究证实CYP2E1可以直接通过HIF-1α介导KCs基因表达和功能转化。而KCs的功能转化在肝癌的细胞维持、免疫逃逸和转移复发过程中扮演了极其重要的作用。可见,CYP2E1有望成为防治肝癌的新靶点。
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Establishment of hepatocellular carcinoma cell line HepG2 stably over-expressing CYP2E1
XIONGYong-fu1,YANZai-hua,YANGZhao,LIJing-dong
(1NorthSichuanMedicalUniversity,Nanchong637000,China)
Abstract:ObjectiveTo establish a hepatocellular carcinoma cell line HepG2 which highly expressing CYP2E1 stably. MethodsThe coded sequence (CDS) of CYP2E1 was searched in NCBI website, and lentiviral vector (pLV(Exp)-Puro-CMVm- CYP2E1) was designed and constructed. 293T cells were co-transfected with the vector corresponding lentiviral packaging plasmid (pMDLg/pRRE, pRSV-REV and pMD2.G). Lentiviral (Lenti-Cyp2e1-eGFP-Puro) carrying CYP2E1 gene was used to trasfect HepG2 cell line, and puromycin-resistance screening were performed to establish the HepG2 cell line that highly expressed CYP2E1. The transfection was detected through enhanced green fluorescent protein, q-PCR and Western blotting was used to detect the expression of CYP2E1 mRNA and protein in HepG2, no-load HepG2 cell line and HepG2 cell line transfected by CYP2E1 gene. ResultsHepG2 cell line all transfected CYP2E1 gene successfully. The relative expression of CYP2E1 mRNA in HepG2, no-load HepG2 cell line and HepG2 cell line transfected by CYP2E1 gene was 1.02±0.06, 1.06±0.05 and 7.42±0.07, the protein expression of each group was 0.26±0.02, 0.29±0.01 and 1.61±0.08 respectively. HepG2 cell line transfected by CYP2E1 gene had significant differences as compared with the former two groups (all P<0.05).ConclusionThe hepatocellular carcinoma cell line HepG2 stably and highly expressing CYP2E1 gene is successfully constructed by lentiviral transfection.
Key words:CYP2E1 gene; lentiviral vector; liver carcinoma; HepG2 cells
(收稿日期:2014-12-24)
通信作者简介:李敬东(1970-),男,教授,主要研究方向为肝脏疾病的基础与临床研究。E-mail:lijingdong358@126.com
作者简介:第一熊永福(1989-),男,住院医师,主要研究方向为肝癌的基础研究。E-mail:xyf-eva@hotmail.com
基金项目:国家自然科学基金资助项目(81370531)。
中图分类号:R73
文献标志码:A
文章编号:1002-266X(2015)07-0008-03
doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.07.003