维生素D对动物钙结合蛋白等基因表达的调控

■ 李 冲 吴峰洋 陈赛娟 刘亚娟 谷子林，3

(1.河北农业大学动物科技学院，河北保定 071001；2.河北农业大学山区研究所，河北保定 071001；3.河北省山区农业工程技术研究中心，河北保定 071001）

维生素D是一种脂溶性维生素，是一种重要的动 物所需的营养素，已知的有10种形式，其中最主要的是VD3，又称为胆钙化醇。维生素D通过多种途径对动物基因的表达进行调控，同时影响了动物的生长免疫等方面。在动物日粮的添加量中，传统的模式均是以维生素不缺乏为基础的添加，实际研究表明，较高水平的营养素对DNA的维持反应如基因表达、DNA合成与修饰等都是必要的[1]。日粮中的维生素D进入体内，主要以催化剂和辅酶的形式参与生理活动，保证各组织和器官的正常功能，同时研究表明，维生素D对多种基因的表达有调控作用。Paul等研究表明，让慢性肾病人口服维生素D2可以降低PTH的水平[2]。1,25(OH)2D3作用于靶细胞后会产生非基因效益和基因效益两种不同的信号传导系统，目前对维生素D的研究不仅局限于宏观上对动物生长、免疫及发育等方面，在基因表达水平的研究使得维生素D更受到重视。

1 维生素D在生命活动中的意义

维生素D是一种脂溶性维生素，属于固醇类衍生物，是人和动物必需的营养元素。最早在1930年由德国的A.Windaus教授首先确定其化学结构，直到1936年正式确定其化学特性。维生素D可以在体内合成并长期贮存。主要包括5种化合物，VD2和VD3是最主要的两种形式，两种维生素D来源不同。VD2来源于植物，是由其体内的麦角固醇经过紫外线照射后转变得到，而VD3是由动物皮下7-脱氢胆固醇在紫外照射下经光化学反应转变而成。维生素D3进入体内后由于其本身不存在活性，不能直接发挥作用，需要进一步代谢才能参与生理活动。VD3的代谢产物包括1α,(OH)D3、25α,(OH)D3和1,25(OH)2D3。其生物学效价大体为维生素D3≤25α,(OH)D3≤1,25(OH)2D3，可见其中活性最强的是1,25(OH)2D3[3]。维生素D3进入体内后，首先进入肝脏细胞，在25-羟化酶的催化下脱氢生成25(OH)D3[4]，再进入肾脏，经过1-α-羟化酶的作用，转化为活性最强的1,25(OH)2D3[5-6],机体通过调节羟化酶的活性来调节1,25(OH)2D3的合成，进一步转运到肠道、骨骼和甲状腺等靶细胞中再依赖维生素D受体发挥生理功能。研究表明，1,25(OH)2D3进入肠道细胞后，与VDR结合使其构象改变，活化VDR与类视黄酸X受体结合，二者结合形成的异二聚体则进一步与靶基因启动子区域的VD应答原件结合，促进相关靶基因的表达，与钙转运相关蛋白的表达水平的改变影响钙的吸收[7]。1,25(OH)2D3通过促进肠道对钙磷的吸收，肾小管对钙磷的重吸收，协同PTH促进骨脱钙，调节钙磷代谢，保证骨骼的正常发育。李万佳[8]研究结果显示，日粮中的VD能够促进獭兔免疫器官的发育和生长，同时还能系统地提高抗氧化性。

2 维生素D对动物基因表达的影响

2.1 维生素D对钙结合蛋白基因表达的影响

钙结合蛋白是一种与Ca2+有高度亲和力的蛋白质，这些蛋白质在催化性能上除了包括有活性的酶类，如生物膜上与钙离子运输有关的ATP酶等，还包括无活性的钙结合蛋白CaBP，如调钙蛋白CaM和肌钙蛋白C等，它们发挥生物学作用都是通过与Ca2+的结合使自身构象改变来实现。CaBP-D9k和CaBPD28k都是维生素D依赖型的钙结合蛋白，目前发现的CaBP-D28k主要分为两种：一种在鸟类体内，一种在哺乳动物体内。不同的是前者的CaBP-D28k存在四个钙离子结合位点，而后者只有两个结合部位，主要参与Ca2+运输和吸收[9]。哺乳动物中，CaBP-D28k在肾脏和中枢神经系统中浓度较高，而CaBP-D89k主要集中于小肠。这两种蛋白由不同的基因控制，但都受到1,25(OH)2D3水平的调节。1,25(OH)2D3对靶基因表达的调节作用依赖维生素D受体(VDR)和一些转录因子(TF)的共同作用。VDR分为膜受体(mVDR)和核受体(nVDR)，其中nVDR属于核受体超家族成员，是1,25(OH)2D3发挥效应的主要蛋白，在几乎所有的有核细胞中均能表达，并广泛存在于各个组织细胞。VDR蛋白的结构有五个结构域，包括DNA结合结构域(DBD)和配体结合区(LBD),其中LBD区是1,25(OH)2D3的特异性结合区域，结合后的VDR发生被PKC和酪蛋白激酶磷酸化的变化[10]。然后受激活的VDR与视黄酸X受体(RXR)发生异二聚化反应形成异二聚体，该复合物通过其DBD区结合在钙结合蛋白基因的特定序列片段(VDR应答元件)，引起启动子DNA发生弯曲。磷酸化后的VDR由于其构象发生了改变，使其本身与其他相关转录因子发生作用，再加上RNA聚合酶的作用开启了启动子的转录，从而加速转录，促进钙结合蛋白的合成[11]。

2.2 维生素D对钙结合蛋白的非基因性调节

1,25(OH)2D3还会通过非基因效应对Ca2+吸收进行调节，即与一个膜蛋白受体（1,25D3-MARSS结合蛋白）结合[12]。研究发现，1,25D3-MARSS结合蛋白属于二硫化物异构酶家族的应激蛋白，可作为能够调节血钙和血磷的PTH激素的受体[13]。1,25(OH)2D3与MARRS结合后通过G蛋白激活腺苷酸环化酶产生第二信使cAMP,进而激活蛋白激酶A。通过PKA通路释放的β-葡萄糖苷酸酶能够提高瞬时受体电位通道蛋白6（TRPV6）的活性，进而对Ca2+进行调节[14]。除此之外，与膜受体结合后G蛋白的激活还使得与其相关联的Ca2+通道打开，形成的Ca2+流能够激活磷酸肌醇酶PIC，PIC是一种磷脂酶，能够断裂PIP2中磷酸基与甘油之间化学键的断裂生成IP3和DAG。IP3能够促进钙库中Ca2+的释放，而DAG是提高蛋白激酶C活性的第二信使，PKC进一步加速了Ca2+的内流[11]。另一方面，1,25(OH)2D3与膜受体结合后形成的Ca2+流激活磷脂酶A2，磷脂酶A2能够增加膜的通透性，又促进了Ca2+的跨膜[15]。

2.3 维生素D对甲状旁腺素受体（PTHR）基因表达的影响

甲状旁腺素(PTH)由甲状旁腺分泌，是调节血钙和血磷的主要激素之一，对无机离子的重吸收起重要作用，同时还能激活肾脏内的1,25-羟化酶的活性，促进1,25(OH)2D3的转化。1,25(OH)2D3能够使甲状旁腺素受体(PTHR)基因转录成mRNA的水平降低，该过程是在大鼠造骨细胞中通过抑制P2增强子活动实现的[16]。

2.4 维生素D对骨保护素（OPG）基因表达的影响

1997年,美国加州分子遗传学实验室的Simonet等鉴别出一种被称为osteoprotegerin(OPG)能调节骨吸收的糖蛋白，是一种肿瘤坏死因子受体超家族的新成员，在体内转基因鼠的肝脏中表达OPG可以导致严重的骨质硬化[17]。临床研究表明，1,25(OH)2D3能抑制成骨细胞OPG mRNA表达，并随其浓度的增加抑制作用增强；同时，另一方面促进RANKL mRNA表达，并随浓度增高作用增强；1,25(OH)2D3还可以抑制成骨细胞OPG蛋白的合成，这种作用随浓度的升高而减少；长期应用1,25(OH)2D3可以降低骨质疏松患者的脊椎和髋部骨折的发生率[18]。

3 维生素D对其他基因的调控

由肾脏分泌的24-羟化酶是将有活性的1,25(OH)2D3转化为没有活性的维生素D，依据24-羟化酶的自身反馈调节，当过多的1,25(OH)2D3合成时，就会诱导24-羟化酶基因的表达，生成的24-羟化酶进一步使得1,25(OH)2D3减少，从而维持VD在体内的平衡[19]。在对OB细胞的研究中，中低浓度的1,25(OH)2D3能够促进骨保护素OPG基因mRNA的表达，而高浓度则起到抑制的作用[20]。在对大鼠的研究中，GSH大鼠中BMP2基因的mRNA的表达比正常SD大鼠降低，主要原因为1,25(OH)2D3能与VDR复合后结合在BMP2的转录调控区，抑制了基因转录[21]。