白藜芦醇对帕金森病小鼠行为表现及对多巴胺能神经元NF-κB蛋白表达的影响

徐芳(枣庄科技职业学院，山东滕州277599)

白藜芦醇对帕金森病小鼠行为表现及对多巴胺能神经元NF-κB蛋白表达的影响

徐芳
(枣庄科技职业学院，山东滕州277599)

摘要:目的探讨白藜芦醇对帕金森病( PD)小鼠行为表现及对多巴胺( DA)能神经元核转录因子-κB( NF-κB)蛋白表达的影响。方法①体内实验: 50只雌性褐鼠随机均分为五组，1组模仿卵巢切除术行假手术; 2组行双侧卵巢切除术; 3组手术同2组，术后1周腹腔注射生理盐水连续4 d，腹腔注射MPTP连续7 d; 4组手术同2组，术后1周腹腔注射白藜芦醇连续4 d，腹腔注射MPTP连续7 d; 5组手术同2组，术后1周腹腔注射雌激素连续4 d，腹腔注射MPTP连续7 d;比较各组爬杆实验得分。②体外实验:当体外培养的MES23.5 DA能细胞密度达到60%时，A组换用无血清培养基; B组换用加有MPP +的无血清培养基; C组较前两组提前30 min换用加有白藜芦醇的无血清培养基进行预处理，30 min后换用同时含有白藜芦醇和MPP +的无血清培养基。培养24 h后，采用Western blotting法检测三组细胞中NF-κB蛋白。结果1、2、3、4、5组爬杆实验得分分别为( 8.39±1.21)、( 5.62±0.90)、( 3.79±1.17)、( 8.01±1.03)、( 8.27±1.39)分; 2、3组得分低于其他三组，P均＜0.05。B组细胞质NF-κB蛋白表达量较A组减少约57%( P＜0.05)，C组细胞质NF-κB蛋白表达量较B组增加约54%( P＜0.05)。B组细胞核NF-κB蛋白表达量较A组增加约76% ( P＜0.05)，C组细胞核NF-κB蛋白表达量较B组减少62% ( P＜0.05)。结论白藜芦醇可减轻MPTP致PD小鼠行为学表现，机制可能与其抑制DA能神经元内NF-κB核易位有关。

关键词:帕金森病;白藜芦醇;核转录因子-κB;核易位;小鼠

帕金森病( PD)主要病理改变是中脑黑质多巴胺( DA)能神经元进行性变性缺失，但其确切病因和发病机制尚不清楚［1］。天然提取物白藜芦醇属于植物雌激素，具有抗氧化损伤和抑制炎症反应等作用。研究证实，白黎芦醇能有效保护中枢神经元，如能减轻6-OHDA诱导的PD大鼠黑质DA能神经元凋亡及其氧化应激损伤［2］。2012年7月～2014 年6月，本研究观察白藜芦醇对MPTP致PD小鼠的神经保护作用，并探讨其作用机制。

1　材料与方法

1.1材料10～12周龄、体质量25～30 g的C57/BL雌性褐鼠(对MPTP敏感性高) 50只，自由生活在12 h∶12 h昼夜循环光照环境中，室温( 19± 2)℃。MES23.5 DA能细胞系由美国PD研究所乐卫东教授惠赠。MPTP、MPP +、白藜芦醇均为Sigma公司产品; NF-κB抗体( 1∶200)、细胞增殖核抗原( PCNA)、羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG均为美国Santa Cruz公司产品;β-actin抗体( 1∶500)为博奥森公司产品。

1.2体内实验

1.2.1动物分组及处理取50只雌性褐鼠，随机分为五组，每组10只: 1组:水合氯醛麻醉后，模仿卵巢切除术行假手术;术后1周腹腔注射生理盐水，1次/d，连续11 d。2组:麻醉同前，行双侧卵巢切除术;术后1周腹腔注射生理盐水，1次/d，连续11 d。3组:手术同2组;术后1周腹腔注射生理盐水，1次/d，连续4 d;然后腹腔注射MPTP( 20 mg/kg)，1次/d，连续7 d。4组:手术同2组;术后1周腹腔注射白藜芦醇( 30 mg/kg)，1次/d，连续4 d;然后腹腔注射MPTP( 20 mg/kg)，1次/d，连续7 d。5组:手术同2组;术后1周腹腔注射雌激素( 50 mg/kg)，1次/d，连续4 d;然后腹腔注射MPTP( 20 mg/kg)，1次/d，连续7 d。

1.2.2行为学观察给药后立即观察各组是否出现竖毛、动作减少、尾巴过伸等急性PD症状。同时进行爬杆实验，记录小鼠从小球上下来所需时间、爬完杆子上半部所需时间、爬完杆子下半部所需时间［3］。

1.3体外实验

1.3.1细胞培养MES23.5 DA能细胞接种于预先涂有多聚赖氨酸的培养瓶中，培养基为含有5%胎牛血清及2% Sato's的DMEM/F12培养基，培养

环境为37℃、5% CO2温箱。采用倒置显微镜观察细胞，根据其生长情况进行传代。

1.3.2细胞分组与药物处理取对数生长期细胞，以2×104/mL接种于6孔板中，随机分为三组: A组换用无血清培养基; B组换用加有MPP + ( 10 μmol/L)的无血清培养基; C组较前两组提前30 min换用加有白藜芦醇( 10 μmol/L)的无血清培养基进行预处理，30 min后换用同时含有白藜芦醇( 10 μmol/L)和MPP +( 10 μmol/L)的无血清培养基。

1.3.3细胞中NF-κB蛋白检测三组细胞培养24 h后利用蛋白抽提试剂盒分别提取总蛋白、浆蛋白和核蛋白，分别加适量生理盐水维持每份体积相同。采用Western blotting法检测三组细胞中NF-κB蛋白。

1.4统计学方法采用PPMS1.5统计软件。计量资料采用珋x±s表示;两组间均数比较采用Student's t检验;两组以上均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Turkey's检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组行为表现3组注射MPTP后，立即出现竖毛、动作减少、尾巴过伸等急性PD症状，对外界刺激反应明显迟钝; 4、5组出现相同症状，但症状轻、恢复快; 1、2组未见上述行为。1、2、3、4、5组爬杆实验得分分别为( 8.39±1.21)、( 5.62±0.90)、( 3.79±1.17)、( 8.01±1.03)、( 8.27±1.39)分; 2、3组得分低于其他三组，P均＜0.05;其余组间比较，P均＞0.05。

2.2各组细胞NF-κB蛋白表达B组细胞质NF-κB蛋白表达量较A组减少约57%( P＜0.05)，C组细胞质NF-κB蛋白表达量较B组增加约54% ( P＜0.05)。B组细胞核NF-κB蛋白表达量较A组增加约76%( P＜0.05)，C组细胞核NF-κB蛋白表达量较B组减少为62%( P＜0.05)。

3　讨论

目前，PD的治疗主要以对症治疗为主，无法延缓或阻止中枢DA能神经元变性［4］。雌激素具有中枢神经元保护作用。更年期妇女给予雌激素替代治疗，可以降低PD的发病率，缓解PD患者早期运动障碍、提高其认知能力。但是，雌激素替代治疗增加乳腺癌及子宫内膜癌等的发病率。因此，开发雌激素替代品非常重要。白黎芦醇为植物提取物，其母核结构类似于己烯雌酚，与经典的核内雌激素受体( ER)结合后，发挥雌激素样作用，可改善妇女更年期综合征症状，预防乳腺癌、骨质疏松症、心血管疾病等发生。

本研究结果表明，注射MPTP后PD模型小鼠马上出现竖毛、动作减少等急性PD症状，对外界刺激反应明显迟钝，爬杆实验得分最低;说明MPTP致PD模型制备成功。白藜芦醇预处理和雌激素对照小鼠也出现相同症状，但症状轻、恢复快;爬杆实验得分较PD模型小鼠明显提高;说明白藜芦醇对PD小鼠具有神经保护作用，且其神经保护作用与雌激素效果相当。Panet等［5］发现，NF-κB能够促进氧化应激所造成的DA能神经元退行性变。生理状态下NF-κB存在于细胞质中，与IκB结合形成复合物;该复合物发生磷酸化被激活后，解离出IκB，进入细胞核，与诱导性一氧化氮合酶( iNOS)结合，诱导iNOS转录［6］。激活的NF-κB能够促使DA能神经元内p53、c-Myc基因表达，导致细胞增殖及死亡［7］。研究发现，白藜芦醇能够通过抑制NF-κB的核转移，进而抑制糖尿病患者血管平滑肌异常增殖［8］。抑制星形胶质细胞内NF-κB激活，可对PD患者DA能神经元发挥保护作用［9］。本研究结果表明，白藜芦醇可以抑制MPP +对NF-κB的激活作用，进而抑制MPP +致MES23.5 DA能神经元损伤。

综上所述，白藜芦醇可减轻MPTP致PD小鼠的行为学表现，机制可能与其抑制DA能神经元内NF-κB核易位有关。

参考文献:

［1］王茜，张宇新，张作凤.核因子NF-κB对帕金森病MPTP模型小鼠黑质COX-2表达的影响［J］.第四军医大学学报，2008，29 ( 19) : 1758-1760.

［2］金凤，吴芹.白藜芦醇对帕金森病模型大鼠氧化应激损伤的拮抗效应［J］.遵义医学院学报，2009，32( 1) : 222-224.

［3］郭德玉，于向东，陈彪，等.MPTP致C57BL/6小鼠帕金森病模型的复制及常用的行为学分析方法［J］.实验动物科学，2010，27 ( 2) : 1-4.

［4］王健，彭国光.培高利特对帕金森病大鼠保护作用的初步研究［J］.重庆医学，2006，32( 6) : 729-730.

［5］Panet H，Barzilai A，Daily D，et al.Activation of nuclear transcription factor kappa B ( NF-kappaB) is essential for dopamine-induced apoptosis in PC12 cells［J］.J Neurochem，2001，77( 2) : 391-398.

［6］曾丽平，马韵.NF-κB与弥漫性大B细胞淋巴瘤的关系研究进展［J］.当代医学，2010，16( 7) : 34-35.

［7］Yang HJ，Wang L，Xia YY，et al.NF-kappaB mediates MPP + -induced apoptotic cell death in neuroblastoma cells SH-EP1 through JNK and c-Jun/AP-1［J］.Neurochem lnt，2010，56( 1) : 128-134.

［8］李佳，姜鲜，章卓.白藜芦醇对糖尿病大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响［J］.重庆医学，2010，39( 14) : 1822-1826.

［9］Aoki E，Yano R，Yokoyama H，et al.Role of nuclear transcription factor kappa B ( NF-kappaB) for MPTP ( 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahyropyridine) -induced apoptosis in nigral neurons of mice ［J］.Exp Mol Pathol，2009，86( 1) : 57-64.

收稿日期:( 2014-10-23)

文章编号:1002-266X( 2015) 28-0032-02

文献标志码:A

中图分类号:R742.5

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.28.011