荧光碳点及其在生物医学领域的应用进展

赵菁，丛明宇，赵亮，王丹丹，常蓓，孙宏晨(吉林大学口腔医学院，长春130021)

荧光碳点及其在生物医学领域的应用进展

赵菁，丛明宇，赵亮，王丹丹，常蓓，孙宏晨
(吉林大学口腔医学院，长春130021)

摘要:荧光碳点是纳米材料领域的新兴材料，作为新兴量子点具有生物相容性好、粒径小、荧光稳定无闪烁不漂白、易于修饰等独特的理化特征，这些优势使其在生物医学领域具有广泛的应用前景。目前关于荧光碳点的应用主要集中在生物成像，荧光标记、生物传感器、药物及基因载体等方面。本文综述了荧光碳点在生物医学领域的应用基础，包括其生物相容性、荧光性能、摄取机制，分析了碳点在上述各医学领域的应用现状，并讨论了未来的研究内容和方向以及亟待研究的重要问题。

关键词:荧光碳点;生物医学;生物成像;生物传感器;纳米载体

2004年，美国化学家Walter Scrivens在一次关于单壁碳纳米管的实验中偶然得到了一种荧光纳米材料，并命名为荧光碳点［1］。合成荧光碳点的原料非常广泛，成本低廉，制备方式多样。近年来，许多学者对荧光碳点的合成方法、生物学应用展开了大量研究，并取得了较大进展。荧光碳点的粒径为2～10 nm，具有多色荧光性能，由于其还具有上述易于制备、成本低廉等特征，并且水溶性好、表面官能团丰富、易于修饰、生物相容性优，因此在生物医学领域的发展前景十分广阔。现阶段关于荧光碳点的研究主要集中在生物成像、生物传感器、基因/药物载体等方面。本研究对荧光碳点在生物医学领域的应用现状以及展望作一综述。

1　荧光碳点的生物学性质

1.1生物相容性从目前的研究成果来看，荧光碳点具有非常好的生物相容性。传统的量子点含有金属元素，对生物体的毒性较大，所以一般用于实验研究而不能作为临床上体内示踪的试剂。而荧光碳点则毒性很低，在体内外的实验研究均有报道。有研究将荧光碳点和传统量子点作用于MCF-7细胞和HT-29细胞，并通过增殖、凋亡率及存活率三方面对其毒性进行了评价，结果证明与量子点相比，荧光碳点具有绝对的优势［2］。将碳点与细胞共孵育后，从形态学上看，未发现对细胞产生改变［3］;在体内实验方面，通过小鼠存活率、表现症状、体质量变化、血生化检测、病理学分析等多方面的评估，均未发现荧光碳点的任何毒性作用。为了监测荧光碳点引起的免疫炎症反应，Unfried等［4］就碳点对免疫功能的影响作了研究，发现碳点能够通过增加BALB/c鼠的CD+3和INF-γ分泌，减少CD+4/CD+8所占比例而减少Th1和Tc的反应;但这并不足以使其免疫器官发生形态学上的改变。虽然免疫学的评估需要进一步完善，但是实验发现，在动物活体标记实验中，由于荧光碳点粒径小，可以及时地通过动物肾脏排出体外。

1.2荧光性能近年来，双光子成像材料，如量子点CdSe在体内外成像研究中逐渐被应用，该技术虽然在分辨率上有一定优势，且荧光稳定无闪烁不漂白，但生物相容性较差。而荧光碳点不但具备这样的性能而且具有更好的生物相容性［5］，因此随着双光子成像技术日渐广泛地应用于成像研究，基于荧光碳点的双光子或多光子成像材料将更适于医学领域的应用与研究［6］。实际上，目前荧光碳点的高效荧光性能在生物荧光标记方面已得到一定的研究和应用，并且将利于其进行示踪及对各种相关信号通路的研究。研究发现，发射量子产率随着荧光碳点的尺寸而有所改变，尺寸减小，荧光效率得以提高，说明荧光性能对粒径有一定的依赖性，这一发现将有利于具有更佳性能的荧光碳点的研发［7］。另外，溶剂、pH等因素对荧光碳点的荧光性能也有重要影响［8］，提示在对荧光碳点的设计中应充分、全面考虑上述因素。

1.3细胞对荧光碳点的摄取细胞对纳米材料的摄取方式主要取决于如下三点:①材料的物理化学

性能，如化学组成、尺寸、形状等;②细胞因素，如细胞类型和分化状态;③体外实验微环境或细胞微环境等。值得注意的是，ROS的产生与细胞对一些纳米颗粒的摄取有关，这解释了纳米颗粒细胞毒性的成因［4］。荧光碳点与细胞共孵育后，可见其主要聚集于细胞膜上及细胞质内，仅有少量进入细胞核［9］。传统的纳米亲水分子是以内吞作用进入细胞膜，但是一些分子，如富勒烯、传统量子点等由于其粒径小可以通过渗透作用穿过细胞膜。Ruan等［10］的实验研究表明，荧光碳点进入细胞的方式并非通过内吞作用形成核内体，在线粒体也未见明显定位，这将更利于细胞对碳点的耐受，从而也表现出良好的生物相容性。

关于细胞对荧光碳点的摄取有很多影响因素，荧光碳点的浓度是很重要的一个方面。很多实验表明，随着荧光碳点浓度的增加，细胞的摄取量也随之增加;荧光碳点即使高达500 μg/mL也不会达到饱和状态［10］。另外，荧光碳点被细胞摄取也受温度的影响。Delehanty等［11］将荧光碳点水溶液作用于人乳腺癌MCF-7细胞，结果显示，在37℃下，该细胞能够被激发出明亮的荧光，然而在4℃下，并不能观察到有意义的摄取行为。关于这一现象的具体原因尚未明确，有待进一步探索。对于细胞对纳米材料摄取的研究很广泛，影响量子点进入细胞的方式主要有三种:①钝化材料(例如使用PEI、PPEI-EI等)，这主要与量子点的内在理化性能相关。②用肽、蛋白质等功能性分子或多聚物、药物进行表面修饰，以利于内吞作用或增强与细胞间相互作用。③通过显微注射或电穿孔法直接运送至细胞内。上述方法对干预荧光碳点这种新型量子点的摄取具有一定的指导意义。

2　荧光碳点在的生物医学中的应用

2.1生物成像荧光碳点在生物医学影像学和肿瘤诊断方面具有突出的优势和良好的发展前景。如前所述，荧光碳点表面具有很多官能团，利于进行表面修饰。若将荧光碳点与生物活性分子偶联并特异性靶向某些细胞，在肿瘤的诊断治疗、血管成像等方面将有一定的发展前景。现普遍认为人类许多肿瘤细胞都表现出叶酸受体的明显上调，而在正常细胞中叶酸受体只有少量分布［12］。Song等［3］将4，7，10-三氧-1，13-十三烷二胺钝化的荧光碳点与叶酸结合，利用荧光碳点的荧光特点可以将具有叶酸受体的肿瘤细胞与正常细胞区分开来。Liu等［13］将葡萄糖与聚丙烯酸钠合成了一种荧光碳点，并与叶酸溶液混合，作用于共培养的Hela和HEK-293细胞，通过共聚焦成像证实了该荧光碳点的靶向及示踪性能。由此可见，虽然荧光碳点本身容易被细胞摄取，但是通过简单的钝化步骤及表面基团修饰或设计，可以使其被肿瘤细胞特异性摄取。这种主动靶向行为，结合实体瘤的高通透性和滞留效应这一被动靶向更能够起到靶向诊断和治疗作用。关于碳点靶向肿瘤细胞并且成像的例子不胜枚举，这一性能具有至关重要的诊断治疗价值，尤其在肿瘤细胞与正常细胞难以区分时，在外科的术中切除及获得肿瘤的实时信息方面具有非凡的临床指导意义以及应用价值。除此之外，在生物成像方面，荧光碳点以其独特优良的荧光性能得到了广泛的应用，例如通过实时监测荧光检测体内药物的运输及分布。值得注意的是，量子点还可以用于标记干细胞，观察其分化、转移、蛋白分布等［14］。

2.2作为生物传感器利用荧光碳点可以检测生物体内各种生化物质成分的变化过程，具有生物相容性好、简单易行、灵敏度高、背景干扰小、可检测种类多等特点［15］。例如，用涂硼荧光碳点进行葡萄糖水平的检测，不但能够达到实际应用的标准，并且具有灵敏度高，干扰小的优点［16］。再如，细胞内铜离子稳态的改变最终会产生神经退行性病变，生理和病理情况下的细胞内的铜离子浓度有所不同，因此，对铜离子浓度的监测至关重要。有学者通过制备CQD-TPEA这一荧光碳点实现了对胞内铜离子的监测，并且具有较高特异性和长时间稳定性［17］。

2.3作为药物/基因载体量子点药物载体因能够减少药物的毒性、提高药物效能、增加体内循环时间，靶向或控制药物的释放而逐渐取代病毒载体成为目前的研究焦点。荧光碳点，这一新兴量子点，其表面一般因小尺寸效应的存在，比表面积增加，表面可修饰官能团丰富，可以共价修饰的方式作为药物基因载体、控药释放以及实现监测追踪等功能，在疾病的诊断和治疗中发挥至关重要的作用［18］。国内外学者对荧光碳点载抗肿瘤药物的研究已取得一定进展。有学者将多柔比星［19］、奥沙利铂［20］等抗肿瘤制剂与碳点结合形成荧光碳点-抗肿瘤药复合物，载药效率可高达86%，该载药碳点不但可以以监测荧光的方式进行追踪，并且仍能保留原有的抗肿瘤细胞作用成为高效的药物载体，提示了荧光碳点在抗肿瘤治疗中的应用前景，因此也提示了荧光碳点载药和载基因应用的可能性。除了共价修饰，也可以通过静电吸引实现载药:将带负电的碳点与带正电的介孔二氧化硅纳米颗粒通过静电引力结合而富于表面，设计成生理温度下智能pH响应的控释系

统。介孔二氧化硅内含药物，在中性条件下被表面的荧光碳点封在二氧化硅内部，在酸性条件下(利用肿瘤细胞具有外碱内酸的特殊性)得以释放，从而靶向发挥作用［21］。这也说明荧光碳点在环境响应性生物材料方面具有其一定的应用前景。

荧光碳点在作为纳米药物载体方面具有卓越的优越性，但是在作为DNA载体方面，由于荧光碳点与基因结合后在运送过程中立即释放使其应用受到了限制。有学者在这一方面进行了研究，用聚醚酰亚胺对荧光碳点进行了表面钝化使其功能化，发现聚醚酰亚胺接枝的荧光碳点可以在较低的质量比下通过静电吸引浓缩带负电的DNA，而且能够增强包裹的荧光碳点的荧光性能，这主要是因为其表面的聚醚酰亚胺阳离子聚合物层能够介导质粒DNA的转染。Wang等［22］用Alkyl-PEI2k对荧光碳点进行钝化处理，通过体内外各项实验证明其具有稳定结合、保护、运送质粒DNA和siRNA的能力，成为极其具有前景的安全、高效、可监测基因载体，值得注意的是该荧光碳点对19-23bp的siRNA运载效果较差。

荧光碳点载体的可控释放性能在抗菌药物的使用上也具有应用潜能。将荧光碳点与广谱抗生素盐酸环丙沙星共价结合获得载药碳点［23］，其结合率高于90%，抗生素在24 h内于荧光碳点表面持续可控地释放，且能很好地发挥抑制革兰氏阳性菌和阴性菌活性的作用。这一应用策略对于应对目前滥用抗生素使细菌耐药的状况有特殊意义。

2.4其他众所周知，阿尔兹海默症与Z-DNA具有密切的联系，因此DNA的B-Z转换在DNA纳米技术中引起学者们的关注。研究表明，荧光碳点可以通过与DNA大沟结合减少B-DNA向Z-DNA的转换，但这只是在体外环境下的实验结果，有待进一步的研究［24］。但这一发现无疑扩展了碳点在DNA纳米技术中的应用范围。

单纯的荧光碳点(即不作为药物或基因载体时)对细胞的影响仍存在许多可能性，比如一些荧光碳点具有直接抑制肿瘤细胞生长或杀伤肿瘤细胞的功能。例如，有学者从姜中提取出碳点，发现其对人肝癌HepG2细胞有特异性的杀伤作用，并与ROS的大量产生有关，而且得出其主要功能部分是其原料——姜黄素。有趣的是，该荧光碳点对另两种肿瘤细胞A549(人肺腺癌细胞)和Hela(人宫颈癌细胞)并无明显的杀伤作用，说明其对细胞具有高度选择性［25］。Liu等［26］发现，由柠檬酸和RNase A微波法合成的荧光碳点能够抑制并杀伤MGC-803细胞(人胃癌细胞)，但具体机制尚未明确，可能与制备荧光碳点的原料有密切关系，有待进一步探索，另外，值得注意的是该荧光碳点能够进入细胞核。

3　展望

随着纳米颗粒在组织工程学的蓬勃发展，人们发现通过改变纳米颗粒的表面物理化学性能，能够对干细胞的分化、衰老和病理性组织的更新和再生产生影响［27］。许多碳纳米材料，如单壁或多壁的碳纳米管材料已被证实具有促进干细胞成骨分化从而促进骨组织形成的作用［28］，因而可以推测荧光碳点作为碳纳米材料可能具有同样的功能。另外，已有研究表明，小尺寸的纳米金颗粒水溶液可以通过与胞质内蛋白结合，进而激活MAPK信号通路并促进干细胞的成骨向分化［29］。这一研究结果在纳米材料的应用方面有重要的提示意义，意味着纳米材料本身，即在不作为载体的情况下，可以通过受体蛋白对细胞核产生作用，并进一步产生促进骨组织修复的作用，再次提示荧光碳点单独应用的可能性。值得注意的是，纳米材料的理化性质对其功能往往有着重要影响，包括浓度、大小、形状、表面性能、表面电荷等［14］。当然，制备原料的选择也是至关重要的，这些因素在进行碳点的选择和修饰中都应加以注意。

荧光碳点具有诸多优点，与传统量子点相比，荧光碳点展现出的良好生物相容性，具有逐步取代传统量子点的可能。但碳点也有一定的缺点:①大多数荧光碳点的激发波长处于紫外波段，紫外光对组织的穿透性差，将限制深层组织的光学成像，而且几乎所有生物组织对于紫外光都会产生自发荧光，产生干扰。而近红外光能够深层穿透［30］，因此需要进一步研制在近红外光区发光的碳点。②关于荧光碳点的研究并不全面:比如上述关于碳点对机体免疫系统的影响的研究少且范围局限，只有对鼠的实验监测结果并不能保证人类使用的安全性，而免疫系统作为人类的防御系统至关重要，因此荧光碳点对人体免疫学影响的研究应当引起注意。③在临床应用方面的研究较少，比如荧光碳点的有效给药方式尚缺少文献报道，这也是目前将其用于治疗疾病亟待解决的问题之一。另外，不同的给药方式下碳点的血、尿清除速率不同，相关研究将为下一步的研究奠定基础。

荧光碳点作为新兴的量子点依旧具有值得期待的开发潜能，相信随着不断研究和发展，在不远的将来会对医学领域产生深远影响。

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收稿日期:( 2015-05-08)

通信作者:孙宏晨，E-mail: hcsun@mail.jlu.edu.cn

基金项目:国家自然科学基金资助项目(81320108011，81271111)。

文章编号:1002-266X(2015)36-0089-04

文献标志码:A

中图分类号:R943

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.36.036