卵泡发育和闭锁过程中颗粒细胞自噬和凋亡关系的研究*

谢敏 姜法贵 郭燕君

(嘉兴学院医学院解剖学教研室，浙江 嘉兴 314001)

卵泡发育和闭锁过程中颗粒细胞自噬和凋亡关系的研究*

谢敏1姜法贵1郭燕君2Δ

(嘉兴学院医学院解剖学教研室，浙江 嘉兴 314001)

自噬是细胞质内一些损坏的细胞器或未折叠蛋白被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体中进行降解的过程，也是细胞自身修复和维持生命的重要过程。凋亡则是指生理或病理条件下，细胞受内在遗传机制调控而自动结束生命的过程。研究表明，凋亡与自噬现象共同存在于与卵泡发育和闭锁过程密切相关的颗粒细胞中，但二者的相互联系尚不十分清楚。文章总结了自噬与凋亡在卵泡发育和闭锁中的不同作用，并从二者在颗粒细胞的交叉对话的角度概括了它们之间的关系。

凋亡；自噬；颗粒细胞；卵泡发育；闭锁

颗粒细胞(Granulosa cell，GC)是卵巢中一类十分重要的细胞，它位于卵母细胞透明带的外侧，通常有多层，通过缝隙连接与卵母细胞相连，在卵母细胞体内、外成熟过程中起着重要的作用[1]。二者关系密切：卵母细胞指导颗粒细胞的增殖、分化；颗粒细胞的功能状态会影响卵母细胞的质量和随后胚胎的发育潜能[2]。哺乳动物卵巢中存在普遍的卵泡闭锁现象。由于卵泡闭锁时个体年龄及卵泡发育阶段各不相同，形成闭锁的具体过程也不尽一样。但在闭锁卵泡超微结构的研究中发现卵泡细胞中存在核固缩、胞浆出现空泡、形成闭锁小体等凋亡形态的改变，这些变化首先发生在颗粒细胞中。因此，现在人们普遍认为卵泡闭锁实质就是卵巢颗粒细胞凋亡的结果。最近，研究发现LC3蛋白在大鼠卵泡颗粒细胞中的表达最高，这表明，自噬作用主要发生在颗粒细胞，自噬使颗粒细胞死亡可能参与卵泡闭锁[3]。

1 颗粒细胞自噬和凋亡在卵泡发育、闭锁中的作用

目前认为，细胞死亡包括3种类型: 坏死、凋亡和自噬性细胞死亡。程序性细胞死亡(Programmed cell death)是选择性的清除生物体内医学无用的及危险的细胞。依据形态学划分为凋亡和自噬两种形式。生理条件下，凋亡依赖Caspase参与，染色体浓聚、细胞皱缩、DNA降解和凋亡小体形成等特征，清除单个细胞最终被巨噬细胞发生通过内吞作用后，再由溶酶体执行讲解功能。自噬以自噬体的出现为特征，是一种在进化上保守的真核细胞内的转运泡的运输机制。自噬可以将亚细胞成分如胞质、细胞器和蛋白通过自噬体与溶酶体中的水解酶进行降解，消化后的产物可以进入细胞循环[4,5]。

卵泡发育是一个连续的变化过程，一般可分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡。原始卵泡在无外界刺激的情况下增殖和发育时，只有少数发育，其余保持静止状态。启动卵泡生长需要卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone，FSH)，还需来自颗粒细胞、膜细胞和卵母细胞分泌的调节因子的作用[6]，卵母细胞-颗粒细胞-膜细胞通过相互作用，调节卵泡生长[7]。卵母细胞产生的生长分化因子(Growth differentiation factor-9，GDF-9)通过抑制颗粒细胞凋亡和抑制卵泡闭锁，促进卵泡的生存和增殖；同时GDF-9通过上调膜细胞雄性激素的含量促进腔前卵泡(Preantral follicle)的生长。在卵母细胞中敲除GDF-9，导致颗粒细胞的增殖下降，出现异常的卵母细胞生长，并且卵泡不能发育到次级卵泡阶段。另外，下调GDF-9的表达，可以促进caspase-3的活化和颗粒细胞的凋亡。膜性因子EGF、TGF-a、KGF和BMP-7促进颗粒细胞增殖，抑制其凋亡[8]。

人类早期生长阶段的初级卵泡和次级卵泡颗粒细胞的增殖显著(在数量和尺寸上迅速增长)，颗粒细胞层数逐渐增多，颗粒细胞间出现一些小腔隙，并逐渐融合成卵泡腔。在FSH作用的基础上，经黄体生成素(Luteinizing hormone，LH)的刺激，次级卵泡发育为成熟卵泡。卵巢内的多数卵泡发育到一定的阶段后停止发育并且退化，发生卵泡闭锁现象。大多数哺乳动物的卵巢内卵泡数目会随年龄的增长不断减少，在哺乳动物的卵巢中，只有一小部分的卵泡成熟后参与排卵。出生10天后的小母猪的双侧卵巢中，大约有500万个原始卵泡(牛、羊和小鼠的卵巢中分别有120万、110万和100万个原始卵泡)[6,9]。但生育期的母猪，最后参与排卵的卵母细胞不超过1 600个，少于全部初级卵母细胞的0.14%，其他均闭锁、退化;新生儿两侧卵巢有70万～200万个原始卵泡，7～9岁时约30万个，青春期开始时为4万个，40～50岁时仅有几百个，大量卵泡均先后闭锁[10]。卵泡闭锁是卵母细胞质量选择的一个重要的、正常的生理过程，自噬和细胞凋亡可能参与调节卵巢卵泡的发育和闭锁[3,8]。

自噬和凋亡存在着差异，有研究发现自噬与凋亡存在着分子联系。在死亡受体和线粒体介导的细胞凋亡通路中，Beclin-1是Caspase-3、-7、-8的剪切对象[12]。细胞凋亡和自噬被认为是代表细胞死亡机制的连续部分：自噬为凋亡所必需，自噬先于凋亡，进而促进凋亡；或自噬抑制凋亡，如在肿瘤细胞中自噬使凋亡率下降[13]；再或者自噬与凋亡共同促进细胞死亡，抑制其中之一都会转变为另一种细胞死亡途径[14,15]。在任何情况下，积累自噬体都是调控细胞凋亡的关键过程。Western blot分析表明，刚出生的雌性动物会经历一个由自噬介导而使卵泡闭锁加快的过程，凋亡却在其后的卵泡闭锁过程中占优势，因此卵巢卵泡的发育和闭锁过程可能包括凋亡和自噬两方面[8,16]。

青春期前大鼠卵母细胞体外分离，发现卵母细胞至少表达Caspase-3，Lamp1， LC3三者其中之一。卵母细胞Annexin-V阳性或者MDC阳性。然而，大多数卵母细胞凋亡和自噬标记物都显示阳性反应。在不同的年龄段，卵母细胞凋亡和自噬标记物同时呈阳性反应的相对比例不变。在所有的卵母细胞中都存在LC3-I转化成LC3-II、Caspase-3、 Lamp1、LC3的mRNA都存在。结果显示从新生到青春期前大鼠的卵母细胞呈三种不同的细胞死亡过程：凋亡，自噬和两个细胞死亡的途径参与的混合死亡方式[17]。Choi JY研究大鼠颗粒细胞自噬在卵泡发育和闭锁中的作用发现，在卵泡形成过程中，自噬主要在颗粒细胞中诱导，而且与凋亡显示了很好的相关性[18]。颗粒细胞亚型以自噬或细胞死亡的方式来影响oxLDL依赖LOX-1的活化和TLR4[19]。在人类颗粒细胞LOX-1和凋亡的调节依赖氧化应激，当衰老和肥胖时，其变得过多，因为弥补自噬减弱的能力和抗氧化的效能降低[20]。在人类卵巢Beclin 1，Bcl-2结合自噬相关蛋白免疫定位，可能与黄体的寿命有关系[21]。

2 颗粒细胞自噬和卵泡闭锁

大鼠颗粒细胞通过自噬体的聚集诱导凋亡性细胞死亡研究发现，聚集的自噬体通过减少bcl-2表达和减少随后的Caspase激活来诱导凋亡性细胞死亡[3]。卵泡闭锁可能与细胞的凋亡有关，颗粒细胞是细胞凋亡的主要靶细胞，诱导颗粒细胞自噬，与诱导细胞凋亡密切相关[18]。在卵泡闭锁的早期阶段，Beclin-1主要定位在颗粒细胞中，然而Caspase-3的表达是离散的：在鱼类卵泡闭锁的进展期，即使Beclin-1的信号偏高，Caspase-3仍有明显的表达：在卵泡闭锁的晚期， Caspase-3在剩余闭锁卵泡的细胞中表达水平较高[22]。

LC3蛋白在大鼠卵泡颗粒细胞中的表达最高，这表明自噬作用主要发生在颗粒细胞，自噬使颗粒细胞死亡可能参与卵泡闭锁[3]。用血清饥饿法体外培养大鼠卵巢颗粒细胞，观察其自噬体，发现用10 mmol·L-13-MA 处理过的颗粒细胞中自噬体数量减少，具体机制是3-MA通过抑制class III PI3K的活力来抑制自噬体的形成[23]：与此相反，当用0.1 mmol·L-1Baf A 1处理颗粒细胞后，细胞质中发现众多的自噬体，Baf A1可以通过减少自噬体与溶酶体的融合而引起自噬体的积累[24]。然而，虽然在大鼠颗粒细胞的细胞质中观察到了自噬体的积累，但细胞的死亡率和凋亡率，并不高于用3-MA处理过的颗粒细胞的死亡率和凋亡率，表明在血清不足的条件下，自噬体在颗粒细胞中的积累并不足以诱导颗粒细胞的凋亡。而在血清不足的情况下抑制HeLa细胞中的溶酶体[25]，积累大量的自噬体可以促进细胞凋亡。这表明自噬体积累到一定的水平，可能会促进颗粒细胞的凋亡[3]。超微结构观察发现典型的自噬现象，如在细胞内存在多个自噬空泡[18]，说明在无血清条件下存在颗粒细胞自噬现象。非洲刺毛鼠有腔卵泡发生闭锁的过程较缓慢，Szotys等[26]的研究表明，这与颗粒细胞的成熟状态有关，未分化的比成熟的颗粒细胞更多地发生凋亡。

使用3-MA处理过的大鼠颗粒细胞，Bax和Bcl-2的表达水平并没有变化，但是用Baf A1处理过的颗粒细胞的Bcl-2的表达水平下降，表明Bcl-2的表达水平下降明显与自噬体的积累进而诱导颗粒细胞凋亡有关[3]。由Baf A1诱导的自噬体的积累，使活化的Caspase-9和Caspase-3蛋白表达水平都有显著的增加，表明自噬体的积累增加颗粒细胞的凋亡，是通过降低Bcl-2的表达水平和随后Caspases的活化，再通过活化Caspases进一步降低Bcl-2的表达水平，最终使自噬体积累，诱导颗粒细胞的凋亡[3]。

普通猪和小型猪在卵泡发育方面有很大的不同， 如具有不同的排卵和黄体化模式。自噬对这两种猪中的颗粒细胞的调控也不同。用雷帕霉素处理普通猪和小型猪体外培养的卵泡，发现微管相关蛋白1轻链3A(MAP1LC3A)和自噬蛋白5(ATG5)在颗粒细胞中有较强的表达，并且药物处理后效果更显著。此外，无论有无雷帕霉素处理，普通猪卵泡中的MAP1LC3A和ATG5表达水平都高于小型猪。用雷帕霉素处理小型猪的颗粒细胞，发现雷帕霉素提高LC3A-I和LC3A-II的水平：而相同的处理普通猪颗粒细胞，LC3A-I水平上升，LC3A-II水平下降，说明自噬在调节猪卵泡细胞重塑系统中发挥重要作用[27]。在正常猪和小型猪中囊状滤泡中MAP1LC3A的表达是不一样的，这种观点可以解释小型猪独特的卵泡发育特征。

用oxLDL处理体外培养的人类颗粒细胞，发现6 h后大约有30%的细胞MAP LC3阳性。可溶形式LC3-I、LC3-II分子的表达变化情况并不明显；颗粒细胞的中间丝、微管等细胞骨架成分也参与形成自噬体[28]。处理12 h后，未发现LC3-I和LC3-II表达变化[28]。这些结果表明人类颗粒细胞经过oxLDL的处理会发生自噬现象， 用电子显微镜也发现了大量自噬泡的存在。

罗嘉等研究卵泡浆内单精子注射(ICSI)治疗患者卵丘颗粒细胞自噬活性及凋亡水平对卵母细胞质量的影响发现：细胞凋亡及自噬能力参与卵母细胞的成熟及受精过程，并对卵母细胞成熟度过程起到调控作用[29]。细胞凋亡率越高，自噬水平越差的患者，其卵母细胞发育水平越差，受精能力越差[30]。随着Dale 胚胎评分的增加，细胞凋亡及自噬可影响胚胎质量；细胞凋亡越高，自噬能力也差的患者其胚胎质量越差，受孕几率越低。对于受孕成功的患者也可能出现流产、死胎等情况，从而影响患者妊娠结局。卵丘颗粒细胞自噬活性及凋亡水平可影响卵子的成熟度、质量、受精、胚胎发育及妊娠结局。申春艳研究显示：Smad3基因特异的SiRNA及真核表达质粒可以有效地转入大鼠卵巢颗粒细胞中，Smad3基因促进大鼠卵巢颗粒细胞自噬，其机制可能与Bcl-2蛋白相关。

自噬在哺乳动物在胚胎发育中发挥非常重要的作用，在体外成熟诱导自噬可以提高猪卵母细胞核和胞浆成熟，自噬的化学诱导剂rapamycin处理猪卵母细胞体外成熟中对核和胞浆的影响后发现增加LC3-II表达MII期卵母细胞的比例增高，显著提高核成熟。其胞浆成熟标记物p34cdc2激酶和单精受精率要高。在囊胚胚胎中，1 nM rapamycin处理组抗凋亡Bcl-xL转录增加，虽然凋亡前Bax转录水平减少。结果显示IVM中诱导自噬有助于提高猪卵母细胞核和胞浆的成熟[31]。自噬是一个重要的细胞过程，自噬作为泛素系统和降解长寿蛋白质、细胞器维持细胞内稳态的同伴途径。虽然最初表现为酵母，但是，自噬已经被认为是影响哺乳动物发育和疾病的一个重要机制。Becn1是大家公认的肿瘤抑制基因，在人类40-75%的乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中显示，Becn1基因杂合性丧失。因为Becn1自噬的一个关键调节因子，通过条件敲出小鼠的方法来设法研究Becn1基因在雌性生殖中的作用，发现卵巢颗粒细胞缺乏Becn1基因的孕鼠，孕酮产生缺陷，随后早产表型。Becn1基因敲除模型鼠的黄体细胞自噬缺陷以及类固醇生成所需积累脂滴的缺陷。总之，在哺乳动物生殖过程中Becn1在卵泡中提供重要的功能[32]。

在小鼠卵母细胞玻璃化温过程中自噬是否被诱导，MII期卵母细胞玻璃化储存在液氮中至少2周，RT-PCR分析几个自噬基因如Atg5，Atg7，Atg12，LC3a，LC3b，Beclin1在MII期卵母细胞中表达。Atg7和Atg12在mRNA水平有轻微减少，Atg7和Atg12基因表达没有影响。活细胞激光共聚焦分析显示GFP-LC3转基因小鼠来源的卵母细胞显示玻璃化温的卵母细胞比新生的卵母细胞相比，GFP-LC3点状表达显著增高。玻璃化温的卵母细胞BECLIN1蛋白也增加。给予自噬抑制剂3-MA后，并不能显著地影响卵母细胞生存率，试管受精率和温化及试管受精后胚胎的发育率。玻璃化温的卵母细胞中自噬的激活是一种自然的对冷应激的一种适应性反应[33]。

3 调节颗粒细胞自噬和凋亡的相关因子和信号通路

与颗粒细胞自噬相关的信号通路研究较多的是PI3K/PKA/mTOR通路。在体，注射促性激素后，大鼠颗粒细胞中LC3-II表达抑制，p-AKT和p-S6K表达增加。通过代谢清除促性激素后，LC3-II表大增加，p-AKT和p-S6K表达减少。此外，体外给予大鼠颗粒细胞FSH也能抑制LC3-II表达，随后伴随着p-AKT和p-S6K表达增加。AKT抑制剂VIII抑制AKT磷酸化后，抑制FSH介导的S6K磷酸化，LC3-II表达增加。将FSH和AKT抑制剂一起添加与单独添加FSH相比，增加了凋亡的水平和颗粒细胞的死亡。总之在卵泡发育中，AKT介导的mTOR激活抑制颗粒细胞自噬，参与凋亡性细胞死亡调节[35]。瘦素样低密度脂蛋白受体-1介导人类颗粒细胞自噬，可作为程序性细胞死亡的一个旁路[36]。模型鼠香烟烟雾暴露通过卵巢细胞死亡旁路路径导致卵泡损失研究发现，香烟烟雾暴露不能诱导凋亡，但是能激活Atg信号通路，最终导致卵巢卵母损失。我们进一步推测Atg可能是毒物诱导卵巢卵泡损失的一个新机制[37]。

4 展望

自噬和凋亡发生在任何发育阶段的卵泡中，在卵泡发育的各个阶段，自噬可能在卵巢卵泡发育过程中直接决定卵泡的命运(闭锁或是排卵)，但是目前有关自噬在卵巢发育过程中作用的研究报道非常少，众多的具体机制并没有完全被阐明，值得深入研究。自噬因与凋亡之间的复杂交互作用而扑朔迷离。全面理解自噬与凋亡的交互作用及分子机制是目前研究面临的主要挑战。究竟二者之间如何对话共同决定细胞的命运？甚至二者与其它细胞死亡方式如程序性坏死如何实现共同作用？相信通过在细胞、动物模型及人类疾病样本上的动态研究，探索已知的影响卵泡发育和闭锁的途径与自噬间的关系，不仅将加深对卵泡发育机制的认识，同时也将为卵巢早衰、卵巢癌等的深入研究奠定基础，研究结果将为女性不孕不育的原因探索提供理论依据。

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Relationship between granulosa cells autophagy and apoptosis in the process of follicular development and atresia*

Xie Min1，Jiang Fa-gui，Guo Yan-jun2△

(Department of Anatomy, School of Medicine, Jiaxing University, Zhejiang Jiaxing 314001)

嘉兴市科技局课题(编号：2013AY21046)；浙江省大学生科研创新团队资助项目(2015R417003)；嘉兴学院2014年一般SRT资助项目

谢敏，女，嘉兴学院临床医学五年制学生，Email：1729906421@163.com。

Δ通讯作者：郭燕君，女，讲师，主要从事生殖生物学研究，Email：yanjun_guo@163.com。

2015-4-8)