三种主要食物过敏原蛋白及其结构分析

张　楠，布冠好，陈复生，朱婷伟（河南工业大学粮油食品学院，河南郑州450001）

三种主要食物过敏原蛋白及其结构分析

张楠，布冠好*，陈复生，朱婷伟
（河南工业大学粮油食品学院，河南郑州450001）

目前食物过敏已成为世界各地普遍存在的食品安全问题，但引起人体过敏的大多是食物蛋白。本文主要综述了大豆、花生、牛乳三种主要食物过敏蛋白及其结构分析的研究进展，为开发低敏性食物制品提供依据。

食物过敏，蛋白结构，分析方法

近年来，食物过敏已经成为食品安全的主要问题。调查显示世界上约有4%的人口对食物过敏［1］，也有资料显示在西方发达国家，1%～2%的成人与5%～8%的儿童都存在食物过敏现象［2］。据报道显示，已有160多种食物被确认为具有过敏原性，其中牛乳、鸡蛋、鱼、甲壳类、花生、大豆、坚果以及小麦是主要的过敏原来源［3］。儿童主要对鸡蛋和牛乳过敏［4］，而成人主要对海鲜类食物过敏［5］。很多食物在加工过程中会引起食物过敏原结构的改变而影响其过敏原性。因此，食物主要蛋白过敏原结构的研究越发重要。

目前，应用于蛋白质结构分析的方法众多，但在通常的食物过敏蛋白结构性能研究中，主要采用了包括红外（IR）光谱、拉曼（Raman）光谱、圆二色谱（CD）、核磁共振（NMR）、电子显微镜（扫描电镜SEM，透射电镜）、示差扫描量热法（DSC）、热重分析（TGA）、动态力学分析（DMA）等一系列技术手段［6］。尽管检测食物过敏原结构变化的方法众多，但本文主要综述了圆二色光谱法、傅里叶变换红外光谱、核磁共振、扫描电镜、DSC法对大豆、花生、牛乳几种主要过敏原蛋白结构的研究。

1　大豆蛋白过敏原及其结构特点

1.1大豆主要蛋白过敏原

大豆中能引起人和动物发生过敏反应的蛋白质被称为大豆抗原，也称为致敏因子。主要包括：大豆空泡蛋白、大豆疏水蛋白、大豆壳蛋白、大豆抑制蛋白、大豆球蛋白、伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子等。其中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白是主要的致敏蛋白。

1.1.1大豆球蛋白大豆球蛋白是由不同亚基构成的六聚体蛋白，是11S球蛋白的主要成分，分子质量为350～360ku，含有3000个氨基酸残基，成熟的大豆球蛋白由非共价键连接的六个亚基对组成，每对亚基的相对分子质量约60ku，由一个酸性A肽链（35～40ku）和一个碱性B肽链（22ku）通过二硫键连接而成。酸性亚基为A1、A2和A3，其等电点分别为pH5.15、5.40和4.75；碱性亚基主要为B1、B2和B3，它们的等电点分别是pH8.0、8.25和8.5［7］。在不同离子强度、不同的pH环境和不同热处理条件下大豆球蛋白可解离为亚基、成分多肽和半分子形式，但是存在于天然状态下的大豆球蛋白分子结构却十分紧密，很难被酶催化和水解［8］。

1.1.2β-伴大豆球蛋白β-伴大豆球蛋白现已被证实为一个三聚体蛋白，也称7S蛋白，其分子质量在150～200ku之间，该三聚体的聚集和解聚与溶液pH和离子强度密切相关，它由α、β、a’3个亚基组成，它们的相对分子质量分别是67、50和71ku［9］。β-伴大豆球蛋白可在低温条件下溶解，等电点pI分别为4.90、5.18、5.66～6.00［10］。目前，有研究将β-伴球蛋白的含量作为评价大豆蛋白营养价值的指标之一［11］。

1.2大豆主要过敏原的结构特点分析

大豆蛋白中常见的二级结构元件主要由α-螺旋方法，β-折叠和无规则卷曲。研究发现，检测大豆过敏原二级结构的变化主要有CD色谱、红外光谱、DSC、SEM等方法。目前有多人已对大豆及大豆制品复合物的结构作出了相关研究。Marcone等［12］运用CD色光谱测得大豆球蛋白的α-螺旋含量为16%，β-折叠含量为56%。Zhao等［13］通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）方法研究大豆中的7S和11S球蛋白的二级结构，发现两种大豆球蛋白二级结构主要为β-折叠和β-转角，7S中β-折叠含量为45.6%，β-转角为35.9%；11S中β-折叠含量为47.3%，β-转角为35.8%，其中的α-螺旋则可以忽略。Zhang等［14］通过采用电泳、CD、紫外、DSC等方法研究了在高压条件下的大豆球蛋白的构象变化，发现大豆球蛋白会分解成亚单位，同时这些亚基的构象经过高压加工已被改变。DSC结果分析表明，大豆球蛋白在400MPa的压力下经过10min处理后已变性；CD结果分析则表明，大豆球蛋白在500MPa的压力下经过10min处理后，一些α-螺旋和β-折叠结构的有序结构被破坏从而变成无规卷曲。段春红等［15］利用电泳、SEM、FTIR，分析了大豆7S球蛋白及其不同水解度的碱性蛋白酶酶解产物的结构特征，FTIR的结果分析表明，7S球蛋白在酶法水解过程中各种构象所占的比例发生了很大的变化，其二级结构发生了不同程度的变化。由于大豆过敏蛋白成分复杂，同时大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白两种主要致敏原组分会随着外界环境条件的变化发生着解聚与再聚集，因此研究大豆蛋白构象状况及变化规律极其重要。另外，许彩虹［16］通过FTIR、CD、紫外等研究了大豆7S球蛋白糖基化产物结构，FTIR、CD的分析结果均表明，蛋白质二级结构的β-折叠有部分转化为α-螺旋或无规则卷曲结构，二级结构仍以β-结构为主。紫外光谱扫描分析，蛋白质在接入多糖链后，蛋白质肽链会展开，导致了一些位于分子内部氨基酸的暴露，紫外强度增强。这些都为未来大豆过敏蛋白及其制品结构的研究开辟了道路。

2　花生蛋白过敏原及其结构分析方法

2.1花生主要蛋白过敏原

花生中的过敏原主要是分子量在0.7～100ku之间的高度糖基化蛋白质，它们来自于不同的蛋白质家族［17］。有研究发现，花生过敏原蛋白有Ara h1、Ara h2、Ara h3、Ara h4、Ara h5、Ara h6、Ara h7、Ara h8和某种脂蛋白9种蛋白成分，其中Ara h1、Ara h2、Ara h3被认定为主要过敏原，它们可被90%以上对花生过敏的患者血清IgE所识别［18］。目前，对Ara h1、Ara h2、Ara h3这3种蛋白结构研究较多。

2.1.1Ara h1Ara h1占花生蛋白总量的12%～16%，是花生过敏原中含量最高的过敏蛋白，是一种分子量为63.5ku，等电点为4.55的糖蛋白，在天然状态下以三聚体形式存在［17］。其热稳定性强，耐酶解，不易消化，与豌豆蛋白的序列相似性为40%，是花生中致敏性较强的组分之一［19］。

2.1.2Ara h2Ara h2是一种含有172个氨基酸的蛋白，属于2S白蛋白家族，分子量为17～20ku的同种异型蛋白，其pI值为5.2，占花生蛋白总量的10%左右［20］，也是花生蛋白的主要过敏原。

2.1.3Ara h3Ara h3是一种分子量为57ku的致敏糖蛋白，属于cupin类型［17］，由氨基端结构域和羧基端结构域构成，这两个结构域内各有一个保守的cupin折叠，其中cupin折叠结构是由2组反平行β折叠片、无规则环和1个α螺旋组成，Ara h3的62%～72%序列与大豆球蛋白相同［21］。

2.2结构分析方法研究进展

迄今为止，对花生主要过敏原蛋白及其糖基化产物结构的研究取得了较大进展，使其结构被更清楚地揭示。徐宏等［22］利用圆二色光谱和荧光光谱对花生蛋白的二级结构进行了研究，发现α螺旋的含量为45%，β折叠含量大于15%。胡纯秋等［23］采用CD、ANS荧光探针结合紫外可见（UV-Vis）光谱等方法，在不同温度和时间加热花生过敏原Ara h2，CD色谱分析表明，Ara h2经热处理后其二级结构发生变化，其α-螺旋比例有所降低，而β-折叠比例均有所升高；紫外光谱显示，处理温度在55℃以上，包埋在蛋白质分子内部的氨基酸残基暴露出来，其紫外吸收值均升高。赵冠里［24］通过采用电泳、CD、紫外、DSC等方法研究花生过敏蛋白与多糖接枝后的构象变化，DSC结果表明，蛋白糖接枝前的热变性温度低于接枝反应产物的温度；DC结果显示，花生分离蛋白与葡聚糖的混合会引起花生蛋白中的α-螺旋和无规则卷曲结构略微的降低，而与此同时，花生蛋白中β-折叠所占二级结构的比例增加。另外，Liu等［25］利用电泳、CD、DSC等技术相结合研究了花生蛋白与葡聚糖糖基化后结构的变化，CD结果表明，反应过后花生蛋白的二级结构发生了变化，α-螺旋与无规卷曲数量减少，β-折叠比例增加，β-折叠无明显变化。可见，花生过敏蛋白及加工过程结构的研究已较完善，为今后深入研究其结构，降低其抗原性提供基础。

3　牛乳主要过敏原及其结构特点分析

3.1牛乳主要蛋白过敏原结构

牛乳过敏是由乳及乳制品中的蛋白过敏原所引发的一种变态反应，它是由IgE介导或非IgE介导的免疫反应，绝大多数的牛乳蛋白都具有潜在的致敏性，目前，普遍认为酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白是3种主要的过敏原［26-27］。

3.1.1酪蛋白酪蛋白（casein）在牛乳中占蛋白质总量的80%～82%，由αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白4种独立的蛋白组成，含有人体8种必需氨基酸，是一种全价蛋白质（以酪蛋白胶束状态存在，能够为生物体生长发育提供必需的氨基酸［28］。其中，αs1-酪蛋白是酪蛋白中最主要的一个过敏原蛋白，凡是对酪蛋白过敏的人，基本上会对αs1-酪蛋白过敏［29］。

3.1.2β-乳球蛋白β-乳球蛋白一般是二聚体，其每个单位为18ku，它是牛乳中主要乳清蛋白的成分，占乳清蛋白的50%，是牛乳中主要的致敏原，在体内易引发过敏反应，IgE介导的牛乳过敏病人大多对β-乳球蛋白过敏［30］。另外，β-乳球蛋白发生免疫反应需要一个完整的三级结构［31］。

3.1.3α-乳白蛋白α-乳白蛋白分子量为14ku，单体由123个氨基酸的球形蛋白组成，属溶菌酶家族，占牛乳清蛋白的25%，含有4个二硫键，结构非常稳定。另外，在动物模型中，α-乳白蛋白中成环的肽段（60～80），S-S（91～96）是最主要的抗原部位［31-32］。

3.2结构分析研究

近几十年来，随着高新技术的发展，同时在前人提出的理论基础之上，多人对牛乳过敏蛋白及其加工后结构的研究有了很大提高。杨同香等［33］利用Trp和ANS荧光质谱技术对牛奶酪蛋白结构进行了研究，发现低蛋白浓度对酪蛋白结构的变化影响不明显。Kim等［34］采用CD色谱法研究，将天然β-乳球蛋白在80℃的中性环境下加热5min，α-螺旋从原来的16%降低到12%，不规则卷曲的含量从38%增加到43%，从而可看出该乳蛋白二级结构的变化很小。Navarra等［35］运用FTIR技术研究了不同的金属离子对β-乳球蛋白构象的影响，结果显示，在较低温度下锌离子能促进β-乳球蛋白的聚合；同时铜离子的结合使β-乳球蛋白的二级结构发生了变化。Ashton等［36］运用拉曼光谱法研究了不同pH对α-乳白蛋白的结构影响，结果表明，当pH为6.5～4.6时，主要是β-折叠发生了较大变化；而pH为3.6～1.8时，α-螺旋、β-折叠、无规卷曲等二级结构均发生了变化，同时，侧链上暴露于溶剂中的氨基酸残基也发生了变化。国内研究方面，林花等［37］用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳研究牛血清白蛋白-葡聚糖的接枝改性，经染色得到反应体系生成了以共价结合的糖蛋白复合物，结构发生了变化。孙炜炜等［38］通过电泳、CD、红外、SEM、内源荧光分析乳清蛋白与葡聚糖接枝改性，从电泳图谱得知，两者确实发生了以共价键形式结合为基础的接枝反应，生成了分子量较大的物质。由圆二色谱分析可知，接枝产物的α-螺旋和β-转角含量减少，β-折叠和无规则卷曲含量增加。FTIR分析结果表明，糖分子的共价接入导致羟基和碳氧键的吸收峰强度增加；酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带峰形的变化进一步说明蛋白质二级结构破坏。SEM图谱显示，接枝物中并未出现典型的球状结构，而是以混乱的片状结构形式出现。仁珊等［39］利用美拉德反应制备β-乳球蛋白与低聚异麦芽糖结合产物，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析得到结合物相对分子量为44ku，仍保持原有二聚体结构。以上研究对进一步探讨牛乳蛋白结构、抗原性、过敏原性具有重要的指导意义。

4　展望

随着食品安全问题日益成为广大人民群众关注的焦点，食物过敏原结构的研究变得越发重要。目前，有很多方法已广泛应用于检测食物过敏原加工后结构的变化，但由于每种方法都存在一定的局限性，这就对过敏原结构变化的研究提出了新的挑战。同时，随着各交叉学科的发展及研究的不断深入，色光谱学技术与其他分析技术（如电泳、扫描电镜）的联用，在一定程度上促进了过敏原蛋白结构的研究。另外，在食物过敏原蛋白结构的研究中，发现有较少研究将一些相关的免疫学性质与过敏蛋白结构相对应，因此这一方向将会成为今后重要的研究课题，为进一步推动食物过敏原蛋白结构及其过敏原性降低的研究提供参考。

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Research on three major food allergens protein and its structures

ZHANG Nan，BU Guan-hao*，CHEN Fu-sheng，ZHU Ting-wei
（College of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China）

Food allergy had become a major safety issue concern worldwide，but human allergy mostly caused by food protein.The recent research progress on the structure of the major allergens in soybean，peanut，milk was focused in this paper.All of these information were useful on account of whey protein for producing hypoallergenic dairy products.

food allergy；protein structure；analysis

TS214.2

A

1002-0306（2015）02-0397-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.078

2014-05-12

张楠（1991-），女，硕士研究生，研究方向：食品蛋白质资源开发及利用。

布冠好（1980-），女，博士研究生，副教授，研究方向：食品蛋白质资源开发与利用。

国家自然科学基金项目（31201293，21176058，31171790）；国家863项目（2013AA102208-5）；河南省教育厅科学技术研究重点项目（14B550013）。