血红素加氧酶-1在慢性肝病发病中的作用研究进展*

嵇小琴 综述，李 磊 审校

血红素加氧酶（Heme oxygenase-1，HO-1），也称为热休克蛋白32，是催化血红素代谢第一步反应的酶，也是该反应体系的限速酶，催化血红素分解为等摩尔的胆绿素、一氧化碳（Carbon monoxide，CO）和游离铁。胆绿素在胆绿素还原酶的作用下生成胆红素。近来研究发现HO-1除了具有已知的参与血红素代谢、抗炎、免疫调节、抗凋亡、抗氧化应激等作用外[1～3]，还在多种肝脏疾病的发生和发展中发挥重要作用。本文就HO-1在慢性肝病发病中的作用研究进展作一综述。

1 HO-1的生物学特性

编码人HO的基因全长约14 kb，由5个外显子和4个内含子组成。5’端区域无TATA或CAAT盒，但在转录起始部位上游 21 bp处有一类似TATA盒的区域称为ATAAAT盒。迄今为止，在哺乳动物中共发现该酶具有三种亚型存在，分别为HO-1、HO-2和HO-3。HO-1作为HO的同工酶之一，其编码基因全长为68 kb，其启动子序列包括许多顺式作用元件，如应力效应元件、热激元件、低氧效应元件、金属效应元件、负调控元件，CAAT/增强子结合蛋白结合位点和NF-κB结合位点。HO-1基因转录可调节多种转录因子如AP-1、Nrf2、Bach1、HIF-1和 ATF-2。

人类HO-1分子含有288个氨基酸，分子量约为32.8 KDa。HO-2主要表达于脑和睾丸组织中，代表组成性表达的HO。HO-3催化血红素降解作用微弱，无法通过诱导产生。HO-1为HO的可诱导型，在大多数组织和细胞中均有基础表达，可以在多种广泛的氧化应激刺激作用下而大量表达[4，5]。鉴于其调控模式，HO-1的诱导表达一般也被认为是一种针对氧化应激毒性的适应性细胞反应过程[6]。后来研究发现HO-1还具有重要的免疫调节和抗炎功能，在动物实验中上调HO-1表达后可以抑制补体依赖的炎症反应。此外，还发现在HO-1基因敲除小鼠在内毒素作用下易罹患脓毒血症，而HO-2基因敲除小鼠则免疫功能正常。一系列动物实验证实，靶向诱导HO-1过表达有利于炎症的控制。目前，HO-1分子在免疫应答反应中的重要作用正在成为研究的热点[7，8]。HO-1分子可由多种物质诱导表达：对乙酰氨基酚、四氯化碳、氟烷/异氟烷以及钴原卟啉（Cobalt protoporphyrin-IX，CoPP）、氯化钴等重金属化合物等[9]。目前认为HO-1主要是通过其代谢产物发挥作用的。

2 HO-1与病毒性肝炎

2.1 HO-1与乙型肝炎 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全世界范围内的重大公共卫生问题。由HBV感染导致的慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌等是我国目前肝病谱的主要组成部分。近10余年来，抗HBV药物研究取得了突破性的进展，HBV感染相关肝病的预后明显改善。另由于计划免疫在我国的广泛开展，新发HBV感染率明显降低。但由于我国HBV感染人口基数巨大，而现有的药物无法有效清除体内HBV，由其导致的相关终末期肝病将是我国今后相当长一段时间内肝病相关死亡的主要原因。近年来，有关HO-1和病毒之间的相互作用的研究主要集中在HIV等非嗜肝病毒方面。在嗜肝病毒方面的研究也主要集中在丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染领域，在HBV感染领域研究尚少。但现有的研究结果提示HO-1除了具有抗炎和免疫调节作用外，还通过多种途径参与了抑制HBV复制的过程，具有重大的研究价值。

早期的一项研究通过对慢性HBV感染患者肝脏组织进行组织学检测发现，相对于非HBV感染者，其HO-1表达明显上调[10]。Protzer U et al在急性HBV感染小鼠模型和HBV转基因小鼠模型中分别观察了调控HO-1表达对急性和慢性HBV感染过程和HBV复制生活周期的影响，发现HO-1具有直接抗HBV作用[11]。给急性HBV感染小鼠腹腔注射HO-1诱导剂CoPP后发现，肝内炎症明显减轻，同时HBV复制受到显著抑制。随后研究者分别在HBV转染细胞系和转基因小鼠对HO-1抗HBV的作用进行了验证并探讨了其作用机制。一系列的实验结果表明HO-1主要通过影响HBV核心蛋白的稳定性，阻断HBV共价闭合环状DNA（Covalently closed circular DNA，cccDNA）转录后各环节。基于该机制，上调HO-1在肝内的表达，除了具有抗炎、抑制HBV复制的作用外，还可以加速耗竭肝细胞内HBV cccDNA库，因此具有重大的研究价值。国内的研究者在高压尾静脉注射急性HBV感染小鼠模型上也进一步证实了HO-1的直接抗HBV作用[12]。

在HO-1抗HIV的机制研究中发现，血红素可以通过特异性地与逆转录酶的特定区段结合，而达到阻断病毒复制的效果。尽管HBV为DNA病毒，但其在复制周期中也存在以前基因组RNA为模板的逆转录过程，是否血红素也可以通过类似的途径发挥作用，Lin L et al[13]通过研究予以了证实。血红素可以与HBV前基因组RNA上的Epsilon区段结合，从而阻断逆转录酶作为引物启动HBV复制的初始阶段。血红素的结合位点位于逆转录酶的N末端，且在嗜肝病毒中该区段相对保守。此外，原卟啉游离碱以及胆绿素可能也通过一定的通路发挥抗HBV的作用，但其具体机制仍待进一步研究明确。

以上研究均表明，HO-1系统参与了机体抗HBV感染的过程，HO-1的诱导剂有望成为人类抗HBV药物研究和筛选的理想选择之一。

2.2 HO-1与丙型肝炎 早期通过对HCV感染者肝组织的研究发现血红素及其酶催化产物可以与HCV发生相互作用。后续的一系列研究证实了HCV可特异性上调HO-1的表达，但其机制尚不清楚。HO-1过表达可以增加氧化应激对HCV复制子细胞的毒性作用[14]。研究发现HO-1的代谢产物铁离子，可以通过二价阳离子与HCV聚合酶高亲和力结合，从而抑制病毒复制[15]。游离铁离子的抗HCV作用在后续的研究中也得到了进一步的验证[14，16]。然而，由于铁载荷增加本身也具有致肝细胞毒性的作用，因而其抗HCV作用在HO-1系统抗HCV机制中的作用不得不重新进行评估。近年来，Zhu Z et al在体外HCV复制子模型中研究发现，HO-1的另一产物胆绿素在抗HCV过程中可能发挥着更为重要的作用，其可能作用机制为抑制HCV NS3/4A蛋白酶活性[17]。与血红素和锌原卟啉具有类似结构的其它卟啉类物质也被证实可以通过诱导HO-1表达而发挥抗病毒效应[18]。Lehmann E et al[19]研究发现胆绿素通过诱导HCV复制子细胞内I型干扰素的产生而发挥抗病毒作用，尽管其机制仍不清楚。诱导HO-1对于IRF3和NF-κB的活化及在核内的聚集过程是必须的，而这正是I型干扰素产生的前提之一[20]。后续的一些研究发现血红素及其相似的四吡咯类物质可能还具有通过促进机体先天免疫系统而发挥积极作用[21]。

3 HO-1与肝纤维化

肝脏不仅是在调节机体代谢中发挥关键作用，在对内外源性的各种毒素的处理过程中也具有关键作用。肝纤维化主要是由于慢性乙型/丙型肝炎、酒精性肝病、脂肪性肝病、非酒精性脂肪肝等引起。尽管其原因多种多样，但在早期都具有相似的炎症过程，可导致肝纤维化并最终进展为终末期肝病。肝纤维化为肝脏对重复损伤修复应答的结果。如果损伤持续存在，则导致肝细胞无法有效再生并发生纤维化，其中肝星状细胞通过产生大量的细胞外基质而在肝纤维化发病过程中发挥关键作用[22]。

在埃及有人通过对慢性肝病患者外周血细胞HO-1 mRNA水平进行检测发现，慢性肝病中其水平明显增加，且与病情严重程度呈正相关，其中在肝硬化患者中其水平尤其高，因此作者认为HO-1在保护氧化应激导致肝细胞损伤的过程中发挥重要作用，推测可以通过诱导HO-1表达来达到保护肝脏的作用[23]。然而，关于HO-1在肝纤维化过程中的作用目前还存在诸多争议。

Guo SB et al[24]研究发现奥曲肽可以通过抑制大鼠肝内HO-1的过表达而抑制肝纤维化进程。Wang QM et al[25]的研究也证实通过Nrf2/Keap通路阻断HO-1的活性以减少肝内铁沉积和CO水平，有利于改善肝纤维化情况并调节门静脉压力。Wang F et al[26]发现增加内源性HO-1的表达可以通过抑制肝纤维化过程，其可能的机制为：保护肝细胞；抑制炎性细胞浸润和肝星状细胞转化。Yang H et al[27]的研究结果也证实HO-1可以通过增强PPARγ表达，减少肝内NF-κB表达而发挥抑制肝纤维化的作用。Barikbin R et al[28]在Mdr2敲除的小鼠体内研究发现，诱导HO-1可以通过调控免疫细胞浸润和增殖以及通过TNF受体而减轻肝脏损伤和慢性炎症。显著减缓肝纤维化进程，抑制肝星状细胞活化，并对已形成的肝纤维化也具有一定程度的逆转作用。此外,还发现其对肝癌细胞增殖和恶性表型也具有抑制作用。

因此，HO-1与肝纤维化的关系及其具体作用机制值得进一步深入研究，以便通过适当的途径调控HO-1而达到阻断肝纤维化进展的目的。

4 HO-1与肝脏肿瘤

肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是全球范围内的重大公共卫生问题，我国为HCC的高发区。作为抗凋亡蛋白之一，HO-1内源性过表达现象已经在多种肿瘤中被证实，因而推测其可能具有促进肿瘤生长的作用。近年来，不断有研究报道HO-1在肿瘤血管生成和转移方面发挥了重要作用，但其机制尚不明了。Zou C et al[29]对HO-1在肝癌转移中的作用进行了研究。通过在不同肝癌细胞系中HO-1基因差异和下游信号通路的研究发现，野生型HO-1过表达可以抑制HepG2细胞的迁移，而HO-1 G143H变异体过表达则会促进肿瘤细胞的迁移。白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）作为介导这一过程的主要下游分子，其表达量和肿瘤细胞迁移均受到HO-1分子的抑制。采用RNA干扰HO-1表达则可以增加IL-6的表达和促进细胞的迁移。体内实验证实HO-1可以抑制肿瘤的生长。因此认为HO-1可以通过IL-6抑制HCC细胞的迁移和生长。Sass G et al对HCC患者肝脏组织和正常人肝组织HO-1水平进行了比较，发现HCC患者表达明显升高。在免疫功能正常的嵌合小鼠体内证实阻断HO-1表达可以加重肝细胞损伤和促进凋亡，降低增殖活性，抑制肿瘤的生长，减少肿瘤血管的发生。据此认为特异性阻断HO-1有望成为未来HCC治疗的策略之一[30]。

5 HO-1与肝脏缺血再灌注损伤（Ischem ia-reperfusion injury，IRI）

肝移植是终末期肝病最终的解决方案。尽管目前多种因素限制了肝移植的发展速度，但肝移植已经逐渐成为临床上治疗终末期肝病的有效手段。IRI目前仍然是导致移植物损伤、失能并最终导致移植术后失败的主要因素。HO-1由于其本身具有的抗炎、抗氧化、抗免疫排斥反应等作用，诸多研究证实其在移植后肝脏缺血再灌注损伤中发挥了重要作用。

Sun L et al[31]在大鼠体内进行原位肝移植发现，采用腹腔注射编码HO-1的AAV表达载体的方式，上调HO-1的表达后可以降低Banff排斥活性指数，减少IL-2和TNF-α产生，阻滞CD4+和CD8+细胞的浸润，同时增加供肝内Treg细胞的数量，最终有效延长受体存活时间，提高生存率。在小鼠体内的研究也得出了相似的结果[32]。Wang CF et al[33]使用Nodosin预处理Wistar大鼠供肝后进行肝移植，结果发现预处理后HO-1表达量和酶活性都显著增强，植入后大鼠血清转氨酶水平、细胞凋亡程度以及Suzuki's评分都明显下降。Matsumi J et al[34]对 29例活体肝移植（Living donor liver transplantation，LDLT）病例进行了研究发现缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）后Kuffer细胞内HO-1含量显著增加。病人呼出CO的量与前述HO-1表达量成正相关；血清丙氨酸氨基转移酶水平也随之升高。后续的研究还发现HO-1可以通过抑制血小板粘附至肝血窦表面，从而减轻IRI而对肝脏发挥保护作用[35]。此外，HO-1还可以抑制肝脏IRI过程中TNF/TNFR1介导的凋亡信号通路[36]。

最近有证据显示多种应激，如活性氧等，引发的自噬具有机体保护作用。研究显示再灌注可抑制大鼠肝内以及原代培养肝细胞内的自噬。使用氯喹等药物抑制自噬，I/R导致的肝损伤会明显加重。 无论在体内还是体外，HO-1均可增加自噬，减少I/R导致的肝细胞内钙离子过载，阻断钙蛋白酶2的活化。认为通过前述途径，肝脏I/R过程中自噬功能受损是导致肝细胞损伤的原因，而HO-1可以通过增强自噬作用而发挥肝脏保护作用[37]。Wang Y et al[38]的研究结果也表明HO-1可以通过p38-MAPK通路诱导自噬而在肝脏IRI中起到保护作用。

6 小结与展望

HO-1在心血管疾病、呼吸系统疾病方面的研究已经较为深入，而在肝病领域的研究起步较晚，但近年来的研究结果已经逐渐证实其在多种肝病中均发挥了重要作用。HO-1系统除参与抗氧化、免疫调节等作用外，其在病毒性肝炎、肝硬化、肝癌、肝移植等慢性肝病中的重要作用不断被发现。根据目前研究结果，HO-1在抗HBV、HCV、调节肝纤维化过程、抗肿瘤、保护肝脏I/R损伤方面均具有重要意义，可以预测其在此类慢性肝病治疗新手段的探索方面具有较好的前景，有望通过调控HO-1系统来改善慢性肝病的预后。

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