乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药相关变异的研究进展*

叶晓玲，刘妍 综述，徐东平 审校

目前，慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染仍然是一个全球性影响人类健康的严重问题，据统计现今全球约有3.5亿多的慢性HBV感染者，导致每年死亡人数约100万，是肝脏相关疾病发病的主要原因[1]，因此需要进行长期抗病毒治疗。临床抗HBV药物主要有：核苷类的拉米夫定（lamivudine，LAM）、替比夫定（telbivudine，LdT）和恩替卡韦（entecavir，ETV）以及核苷酸类的阿德福韦酯（adefovir dipivoxil，ADV）和替诺福韦酯（tenofovir disoproxil，TDF），后者在我国刚刚上市[2]。ADV为中效抗病毒药物，抑制病毒复制的作用较弱，但由于其价格便宜，且在很长时间内为国内唯一批准使用的核苷酸类抗HBV药物，可以抑制核苷类药物的耐药毒株，因而该药被广泛地用于慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的抗病毒治疗，但长期应用引发的病毒耐药已成为临床常见的棘手问题。本文对ADV的耐药相关变异的发生机制、变异形式、临床发生特点和监测与管理等相关研究进展进行综述如下。

1 ADV抗病毒机制

ADV是腺嘌呤磷酸酯化合物阿德福韦的前体药物，其分子式为C20H32NO8P，分子量为501.48，口服后在体内转化成单磷酸腺苷的无环核苷类似物即阿德福韦，阿德福韦在细胞激酶的作用下只需经过一次磷酸化为有活性的代谢产物即阿德福韦二磷酸盐，结构上与脱氧三磷酸腺苷（dATP）类似，它能够竞争性抑制dATP加入病毒引物中，从而抑制逆转录酶的启动，另外，它还可通过阻止病毒负链延长及正链合成发挥抗病毒作用。ADV最初以120mg/d治疗艾滋病病毒（HIV）感染患者，后因肾毒性而被停用。之后于2002年在美国被批准以较小剂量10mg/d用于治疗CHB患者，随后的临床研究显示ADV单一用药或者联合其他药物对于初治CHB患者具有很好疗效[3]。临床上，ADV不仅对HIV、HBV和疱疹病毒有抑制作用，而且对LAM、LdT和ETV等核苷类似物耐药的病毒株仍然具有较好的抑制作用[4]。

2 ADV耐药机制

HBV复制极其活跃，据统计在外周血中每天约有1011个病毒颗粒被释放入血。通常DNA病毒经过DNA–DNA的直接复制，但HBV虽属DNA病毒，但其复制过程却是经过前基因组RNA的中间逆转录过程，需HBV逆转录酶参与。而病毒逆转录酶缺乏3’–5’外切酶校对功能，更易发生错配，因此HBV比其他DNA病毒更容易发生突变，若与ADV相关的耐药突变基因恰好位于HBV DNA聚合酶（P）的逆转录酶区域，耐药变异株就有可能产生并存在于病毒准种中。HBV共价闭合环状DNA（covalently closed circularDNA，cccDNA）是HBV基因组复制中间体mRNA和前基因组RNA的合成模板，是HBV不易清除的关键因素，因此抗HBV需要长期用药，在药物选择性压力作用下，耐药变异病毒株较野生株在药物压力下具有更强的复制竞争力，可被选择性的扩增成为优势株，从而产生了临床的HBV耐药变异[5]。ADV由于对病毒抑制效力相对较弱且耐药屏障较低，因而HBV较易产生耐药变异。

HBV耐药的类型按发生的先后顺序依次为：基因型耐药，即HBV基因组出现了变异，并且通过体外实验已经证实这些变异形式与耐药相关；病毒学突破，即在基因型耐药的基础上发生的血清HBV DNA载量上升一个数量级；临床突破，即在基因型耐药与病毒学突破的基础上发生的血清ALT水平升高和（或）肝脏组织学损伤加重。HBV感染患者接受ADV治疗1、2、3、4、5年 HBV累积耐药率分别为 0%、3%、11%、18%、29%[6]，一旦发生耐药，临床则考虑换用或与其他核苷类药物联合治疗。

3 ADV相关耐药变异

3.1 经典ADV原发耐药变异（rtA181V和rtN236T）

首先报道发现的HBV ADV耐药变异形式是rtN236T[7]，随后又发现了另一种ADV相关耐药变异rtA181V[8]。目前rtA181V和rtN236T两种变异形式是公认的可直接引起ADV耐药的变异形式。Zhou X et al[9]研究161例HBV患者，76例患者（47.2%）出现rtA181V或rtN236T变异，且多数出现病毒学反弹。Villet S et al[10]报道rtA181V变异可导致患者对LAM、ADV、TDF敏感性降低，rtA181位点单个基因的改变可以引起LAM和ADV的交叉耐药。

但对于部分接受ADV治疗的慢乙肝患者，临床检测直接反映HBV复制水平的病毒载量长期未能降至最低检测下限，甚至有些患者出现病毒学突破，而相应聚合酶链式反应（polymerasechain reaction，PCR）产物经直接测序法检测却并未发现经典ADV耐药位点变异株存在。故对于上述现象，在排除患者依从性差、药物剂量不足、药物吸收障碍等因素后，我们可合理推测除了rtA181V和rtN236T两种变异形式之外，与ADV相关的其他HBV耐药变异形式仍然存在。

3.2 新鉴定的ADV原发耐药变异（rtA181S、rtE218G和rtN236V）

3.2.1 逆转录酶区第181位点的丙氨酸被丝氨酸所替代（rtA181S）Liu Y et al[11]应用直接测序法分析了18419例慢性HBV感染者的耐药变异信息，检出rtA181S变异的患者占0.53%（98/18419），在接受ADV治疗的5344例患者中占0.86%（46/5344），通过RT区TA基因克隆发现6例患者在发生病毒学突破时均检测出rtA181S变异，其中1例患者体外表型耐药实验证实rtN236T、rtA181S、rtA181V和rtA181S+rtN236T变异株的病毒复制力均较野生株低（P＜0.05）。表型耐药分析通常用半数有效浓度（50%effective concentration，EC50）或半数抑制浓度（50%inhibitory concentration，IC50）来评价耐药程度的高低，与野生病毒株相比，该值的增高表示耐药性的增加，国际乙肝耐药管理专家共识确定EC50升高2～9倍以上即可证明该变异为ADV耐药变异[12]。该实验结果显示rtN236T、rtA181S、rtA181V和 rtA181S+rtN236T变异株对ADV的耐药倍数（变异株的EC50/野生株的EC50，Fold值）分别为 7.92、3.69、5.62和 9.77，故 rtA181S是一种ADV耐药相关变异，可单独或联合其他变异形式引起患者耐药。但与经典的rtA181V和rtN236T两种变异形式相比，rtA181S变异引起的ADV耐药相对较弱，临床检出率也较低。

3.2.2 逆转录酶区第218位点的谷氨酸被甘氨酸所替代（rtE218G）最近Liu L et al[13]研究86名临床症状表现出对ADV耐药的患者，并进行HBV逆转录酶区核苷酸测序，发现了其中26位患者出现新的ADV耐药位点rtE218G，且rtE218G既可以单独出现也可与rtA181V、rtN236T联合出现。研究者还将构建突变质粒pUC18-HBV1.2-E218G转染入HepG2细胞，结果显示rtE218G突变株与野生株相比，复制力仅为野生株的87%，对ADV的EC50比野生株高5.5倍，故该变异形式是否会引起ADV耐药有待实验进一步证实。

3.2.3 逆转录酶区第236位天冬酰胺被缬氨酸所替代（rtN236V）Liu Y et al[14]从18419例临床大样本资料的直接测序鉴定了6名患者出现rtN236V变异，占0.03%（6/18419），在接受ADV治疗的5344名患者中占0.11%（6/5344），该6名患者均接受ADV治疗，并检出rtN236V变异的同时均出现生化学突破。对其中2例患者行体外表型耐药实验，结果显示rtN236V和rtN236T变异株的病毒复制力均较野生株低（P<0.05）；2例患者rtN236V变异株对ADV的Fold值分别为3.9和3.1，rtN236T变异株对ADV的Fold值分别为4.5和4.75。临床表现和实验数据均表明HBV逆转录酶区rtN236V变异是一种新的ADV耐药变异，与rtN236T相比，rtN236V变异引起的病毒耐药性相对较弱。

3.3 非经典/有争议的ADV耐药相关变异

文献报道的与ADV耐药相关变异类型还有rtA181T、rtV214A、rtQ215H/P/S、rtL217R/P、rtI233V、rtN238T/D/H等[15，16]。这些尚未引起临床广泛认可和重视的变异可单独或联合出现，因临床发生率低，且某些变异形式仍然存在争议，需我们进一步研究。

3.3.1 逆转录酶区第181位点丙氨酸被苏氨酸所替代（rtA181T）HBV逆转录酶区rtA181T单位点变异是否会引起ADV耐药目前仍存在争议，Gish R等[17]报道rtA181T变异通过消除或降低抗病毒药物的基因屏障，从而表现出交叉耐药性，且该变异已在接受LAM、ADV、LDT治疗的患者中检出。2012年EASL指南指出[18]，rtA181T变异可以导致LAM、ADV和LDT耐药，降低TDF敏感性，但对ETV仍然敏感，而Li X et al[19]报道rtA181T变异对ADV没有耐药性。另外，Ahn S et al[20]证实rtA181T变异株的病毒复制力和耐药性依赖于与S区基因的重叠，与rtA181T表面基因错义突变相比（rtA181T/sW172S），rtA181T无义突变（rtA181T/sW172*）可降低病毒复制力和增加药物耐药性，究其原因可能与rtA181T/sW172*变异株的S蛋白被截短有关。此外，rtA181T/sW172*变异还与肝癌的发生有关，这可能是因为S基因截短后，内质网上大量蛋白过量产生和滞留，内质网压力增加，导致DNA损伤以及基因组不稳定，造成肝细胞进一步损伤及肝癌的发生[21]。

3.3.2 逆转录酶区第214位点缬氨酸被丙氨酸所替代（rtV214A）胡爱荣等[22]回顾性分析了290例HBV患者病毒突变的临床特征，变异类型与ADV耐药相关的有88例，预先存在的变异形式与ADV耐药相关的有9例。变异形式主要是 rtA181T（46.59%）和 rtV214A（11.36%），男性、慢性 HBV感染、HBeAg阴性、HBV基因型为C型、终末期肝病、合并非酒精性脂肪肝的患者更易于发生病毒突变。Westland CE et al[23]在一项ADV的Ⅲ期临床实验中经过48周监测之后发现1例患者存在rtV214A变异，但体外实验却发现该位点变异株对ADV完全敏感，笔者认为rtV214A变异与ADV耐药性尚须进一步研究探讨。由此HBV患者需接受规范合理的抗病毒治疗，以避免耐药的发生或挽救治疗而导致病情进展至难治性状态就显的至关重要。

3.3.3 逆转录酶区第215位点谷氨酰胺被组氨酸/脯氨酸/丝氨酸所替代（rtQ215H/P/S）Salpini R et al[24]报道140例感染HBV的耐药患者，rtQ215S所占比率为12.8%，有文献报道在核苷（酸）类似物初治之前，存在与HBV对ADV耐药相关的 rtQ215S变异[25]，而 Amini-Bavil-Olyaee S et al[26]研究249例基因型为D型HBV患者，认为该位点变异更有可能是基因多态性的表现，而非有临床意义的耐药变异。因为经体外表型耐药实验证实后发现，该位点变异株的复制力与野生株相当，且这些位点变异株对LAM、ADV治疗仍敏感，故认为尽管该位点变异于基因D型HBV患者中发生率较高，但其既不会影响HBV的复制能力，也不会导致HBV对ADV耐药。

3.3.4 逆转录酶区第217位亮氨酸被精氨酸所替代（rtL217R/P）Rodriguez-Frias F et al[27]分析了 41例 HBV患者，得出在抗病毒治疗前HBV病毒学某些特征，如HBeAg状态、HBV基因型和rtL217R变异出现，都可能与ADV耐药有关，而Ji D et al[28]从5例不同的HBV患者中获得血清后，对其行表型耐药及Southern blotting分析等技术，证实rtL217P可以明显提高病毒的复制力，且可使rtM204I的复制力恢复，提示该变异形式也许是LAM的一种新型的补偿耐药位点。

3.3.5 逆转录酶区的第233位的异亮氨酸被缬氨酸所替代（rtI233V）rtI233V是否会引起ADV耐药目前尚存在争议，Schildgen et al[29]2006年首次报道了80例对ADV原发性耐药患者中，有3例存在rtI233V变异。经体外表型分析后，rtI233V变异株使ADV的敏感性下降了6至10倍，且该变异形式可以导致患者对ADV耐药。进而他们证实了rtI233V变异与ADV耐药有关，且阐明了rtI233V变异株可取代野生株成为优势株是在ADV的选择压力下发生的[30]。Ahn S et al[20]也提出 rtI233V变异会影响病毒复制力和增加ADV耐药。

然而，与Schildgen在同一团队的Geipel A et al[31]却得出与2006年截然相反的结果，他们仍然采用同样的3例患者血清，不同的是他们此次采用Real-time PCR方法，野生型和rtI233V变异型病毒复制力都随着ADV的浓度的增加而降低，且下降幅度一致，最终证实ADV治疗失败与rtI233V变异无关。Curtis[32]从853例慢乙肝患者中发现有4例具有该位点变异，通过RT区克隆测序和Southern blotting分析等技术，认为rtI233V变异并不会影响ADV的敏感性，证实了rtI233V变异与ADV耐药无关。同样，Ismail AM et al[33]通过蛋白质空间结构的同源模建和分子对接方法，阐明rtI233V变异不会影响蛋白质的催化位点，故他们认为rtI233V变异不会影响ADV的抗病毒作用。

邓俊等[34]利用定点突变技术构建带有rtA181V、rtI233V和rtN236T突变的HBV重组质粒，分别转染肝细胞系Huh7，加入含有不同浓度ADV的培养液，培养3 d后收集细胞DNA，用Southern Blotting分析及相关软件技术，计算出ADV对各个重组质粒的IC50值和各重组质粒的Fold值，得出rtI233V变异株重组质粒的IC50值为（1.69±0.52）μmol/L，Fold值为6.5，rtI233V变异能导致HBV对ADV轻度耐药。

rtN236T突变对HBV聚合酶的三磷酸盐结合位点的间接干扰是其导致ADV耐药的主要机制，而rtI233V突变离236位点只差3个氨基酸，因此，笔者推测此位点的突变也可能对ADV磷酸盐与HBV聚合酶的结合产生影响。基因型的不同、转染细胞株的不同以及所有研究不同质粒的其它位点的差异是否会对病毒复制产生影响并导致最终结果的不同，还需进一步研究证实。另外，HBV耐药机制的复杂性、宿主或病毒的因素和抗病毒治疗过程中表型抵抗或药物依赖性抵抗等原因都有可能影响rtI233V变异与ADV治疗的敏感性之间的关系。

3.3.6 逆转录酶区第238位天冬酰胺被天冬氨酸/苏氨酸/组氨酸所替代（rtN238 D/T/H）朱华等[35]分析了1789例慢性乙型肝炎患者rtN238H变异的发生频率及其与ADV用药的关系，结果证实这 1789例患者中 rtN238H、rtN238T和rtN238D变异分别为 181例（10.1%）、10例（0.56%）和 3例（0.17%），rtN238H变异明显高于另两种变异形式，且基因型以B型为主，为151例（83.4%），ADV经治和未治患者分别为130例（71.8.%）和51例（28.2%），经ADV治疗的 130例患者中产生临床应答（含部分应答）的为107例（82.3%），无应答或出现病毒学反跳的为23例（17.7%），经体外表型耐药分析后证实rtN238H变异是HBV自然发生的多态性变异，对病毒复制力无直接的影响，未能引起ADV的耐药。同样，Zhong Y et al[36]对我国1865例慢性乙肝患者进行研究后发现，rtN238H变异与野生株相比两者复制力无明显差别，且该位点变异对LAM和ADV的敏感性无直接影响，rtN238H变异可能与HBV基因型有关。

4 ADV耐药的监测与管理

目前常用监测HBV耐药方法中表型耐药分析是一种较可靠的实验手段，但操作相对较复杂，也比较耗时。基因序列的测定和病毒载量的跟踪仍为监测耐药的好方法。在患者接受核苷类似物抗病毒治疗前进行HBV基因序列测定，及早发现ADV经典耐药和潜在耐药位点，能帮助医务人员对患者可能发生耐药的时间及程度进行及时评估，有利于耐药的预防。定期监测病毒载量是否反弹，一些非病毒因素，如患者对于药物的依从性、药物的药代动力学不同以及HBV DNA自身的波动等使长期监测受治患者HBV DNA的水平成为必然，这有助临床医务工作者及时采取可靠的治疗措施，避免多重耐药发生。通常如果治疗前患者外周血HBV DNA载量小于106copies/ml，可单用ADV；若HBV DNA载量大于或等于106copies/ml，单用ADV常会出现应答不佳或无应答，这不但使治疗时间延长，还可导致较高的耐药率，此时应首选ETV或TDF，ADV一般不作为首选。

ADV发生耐药后可选择和ADV耐药位点不重叠且无交叉耐药的药物替代治疗，但最近的观点认为，临床上与LAM、ETV或干扰素联合治疗发生ADV耐药的患者优于换成单药序贯治疗，联合治疗能增强抗病毒能力和减低耐药的发生率。对于LAM耐药的患者采用LAM与ADV联合治疗，产生ADV耐药的概率小于换用ADV[37]。

联合治疗可能是未来抗病毒研究的新热点。据报道使用干扰素与ADV联合治疗，不但有助于改善单用干扰素对高载量病毒、高ALT水平疗效欠佳和易出现多种不良反应发生的不足，还可减少单用ADV容易产生耐药及停药易复发的弱点[38]。也有为增强辅助性T细胞1型免疫反应而采用ADV联合胸腺肽等免疫调节剂治疗的报道，当二者联用后，可使HBV DNA的下降速度加快，从而达到快速抑制病毒复制，减少耐药率发生。目前关于免疫调节治疗临床尚未有统一意见，实验研究也较少，能否成为抗HBV治疗的主力还有待进一步研究。

5 小结

ADV耐药率较低，价格便宜，使得临床应用非常广泛，但同样避免不了CHB患者长期治疗临床耐药问题的发生。导致HBV对ADV耐药除了经典和新鉴定的原发耐药变异外，尚存在其他变异形式与HBV对ADV耐药相关，目前明确的有 rtN236T、rtA181V、rtA181S、rtE218G及 rtN236V，还有多种其他变异形式报道与ADV耐药相关，但仍存争议，这些变异形式的重要性仍须通过较大样本量的临床数据资料分析及体外表型耐药实验证实。对ADV耐药相关变异的认识有助于临床更好地诊断与治疗ADV耐药HBV感染。

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