小檗碱和药根碱的光谱行为研究

张跃淑，史文波，李俊芬

（1.中国建筑材料工业地质勘查中心山西总队，山西太原030031；2.山西大学化学化工学院，山西太原030006）

（编辑 杨乐中）

0 引言

小檗碱（Berberine，Ber）和药根碱（Jiatrorrhizine，Jat）是两种季铵类原小檗型生物碱，主要存在于小檗科、毛莨科、防己科、罂粟科等植物中[1~2].小檗碱以治疗肠道菌痢而著称，具有抗菌、降压及利胆等生物活性，并具有潜在的抗癌作用[3].药根碱则具有抗菌、消炎、抗心律不齐、抗病毒和解痉等作用[4~5].

荧光光谱法在有机分子的发光行为研究中具有重要的作用.磷光与荧光相比，具有选择性好、寿命长、stockes位移较大、易于消除荧光背景及散射干扰等优点[6].除常见的溶液中测量外，固体基质发光法包括固体基质室温磷光法（PS-RTP）和固体基质室温荧光法（PS-RTF）.目前关于小檗碱和药根碱的光谱行为的系统研究还未见文献报道.本文研究了盐酸小檗碱和盐酸药根碱在流体中和固体基质上的光谱性质，详细考察了实验条件对其PS-RTF、PS-RTP强度的影响.实验表明：小檗碱和药根碱能直接在滤纸上产生非常强的室温荧光.以TINO3做重原子微扰剂，小檗碱还可发射强的磷光.同样条件下未观察到药根碱的磷光发射.由于室温磷光发射能避开生物样品的干扰，小檗碱在DNA磷光探针的研究方面具有较好的应用价值，也为进一步探讨小檗碱和药根碱的分析应用提供了理论依据（见图1）.

图1 小檗碱和药根碱的结构式

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

F-4500型荧光分光光度计（日本日立公司），附磷光配件.固体基质室温磷光样品架（实验室自制）和自动恒温操作箱（±0.1℃，实验室自制）.体积为5μL、10μL无存液微量进样器（上海安亭仪器厂）.

定量滤纸和定性滤纸（杭州富阳特种纸业有限公司）.

pHS-29A型酸度计（上海雷磁创益仪器仪表有限公司）.

小檗碱和药根碱对照品（中国药品生物制品检定所），用二次蒸馏水配制成1×10-3mol/L储备溶液，并置于暗处保存.硝酸亚铊（上海化学试剂一厂，M=266.4），用二次蒸馏水配制成0.5 mol/L储备液.pH7.40 Britton-Robison缓冲溶液.其余试剂均为国产分析纯.实验用水为二次蒸馏水.

1.2 实验方法

1.2.1吸收光谱测定

在1 cm比色皿中加入2.0×10-5mol/L盐酸小檗碱或药根碱溶液，在紫外可见光谱仪上扫描吸收光谱，考察吸收光谱变化.

1.2.2荧光光谱测定

在1 cm石英杯中固定小檗碱或药根碱的浓度为1×10-5mol/L，然后再在荧光分光光度计上扫描荧光光谱.

1.2.3 PS-RTP光谱的测量

将滤纸裁成17 mm×14 mm大小，在距滤纸的长边边缘4 mm处刻一划痕（不剪断），使刻出的小条与光斑大小相同，标记点样位置.用微量进样器取重原子TINO35μL，滴加在点样位置，在烘箱中（95℃）预烘烤1.0 min后取出，再在同一位置点加样品溶液5μL，继续烘烤1.0 min后取出，装上石英片立即置于F-4500荧光光度计上，设激发和发射通带分别为10 nm和20 nm，扫描速度120 nm/s，进行PS-RTP测量.

1.2.4 PS-RTF光谱的测量

PS-RTF测量同PS-RTP，只是无须加重原子，不做预烘烤.烘烤时间为2.0 min.激发和发射通带分别为2.5 nm和2.5 nm.

1.2.5荧光偏振及RTP寿命测量

根据下式于荧光光度计上测荧光偏振：

P为荧光偏振值，IVV和IVH分别为起偏器为水平方向，检偏器为垂直和平行方向时测得的荧光强度，G为仪器校正因子，IHV和IHH分别为起偏器为垂直方向，检偏器为垂直和平行方向时测得的荧光强度.磷光寿命通过扫描其发光衰减曲线，从计算机上直接读出.

2 结果与讨论

2.1 水溶液中的光谱性质研究

水溶液中小檗碱和药根碱的吸收光谱非常相似，在343 nm左右有比较强的吸收峰，另外在425 nm处还有一个相对弱和宽的吸收峰.以350 nm或450 nm激发，小檗碱和药根碱本身的荧光都很弱，最大荧光发射大约在534 nm处.小檗碱的发射光谱基本来自分子中的异喹啉部分的1 La和1 Lb带[7]，其中1 Lb发射带的荧光强度可被适当极性的溶剂显著增强.

2.2 固体基质上的光谱行为研究

2.2.1 滤纸种类对RTP、RTF的影响

固体基质发光是由于分析物和支持物之间相互作用的结果，不同种类的滤纸RTP或RTF背景强度不同且致密程度也各异[8].对小檗碱和药根碱在几种滤纸基质上的PS-RTP的发射情况进行考察，结果发现，以慢速定量滤纸作固体基质时，RTP、RTF信号均最高且背景信号最低.这可能是因为慢速定量滤纸的纸质致密度适中，有利于发光体的刚性化和滤纸深层处发光体的发射.因此选用慢速定量滤纸作固体基质进行发光特性研究.

2.2.2重原子种类浓度对RTP的影响

重原子对磷光技术有重要影响，能增强分析物的S1→T1系间窜越过程，从而诱导出强的室温磷光信号.经考察，在近三十种重原子中，Tl+对小檗碱的磷光发射有最强的重原子效应，选择TlNO3为适宜的重原子.当[TlNO3]≥0.05 mol/L时，PS-RTP强度随着重原子浓度的增加而增大.当[TlNO3]≥1.5 mol/L时，便可诱导出强的磷光发射.当TlNO3浓度在2.0~3.0 mol/L之间时，PS-RTP强度基本稳定.选择浓度为2 mol/L TlNO3进行后续实验.

2.2.3 干燥条件对RTP、RTF的影响

湿气能严重猝灭室温磷光，破坏基质表面的氢键，同时水分子和基质表面的羟基结合，减弱了基质和磷光体之间的作用，这两个过程协同作用，减少了基质和磷光体间氢键数目，造成磷光体三线态碰撞和振动失活，所以固体基质室温磷光的产生需要维持适宜的刚性微环境.

分别考察干燥温度、预烘烤时间、烘烤时间三个条件对小檗碱和药根碱的发光强度的影响.研究表明，95℃是RTF和RTP测量的最佳干燥温度.烘烤时间的影响表明，RTP适宜的预烘烤时间为1 min.随着烘烤时间的增长，小檗碱的RTP强度增大，超过1.0 min时RTP最强且较稳定（图2，左图）.因此小檗碱RTP检测的烘烤时间也控制为1.0 min.小檗碱和药根碱的RTF测量的烘烤时间分别为1.5 min和2 min.

图2 烘烤时间对小檗碱RTP和药跟碱RTF强度的影响

2.2.4 PS-RTP、PS-RTF光谱

按上述最佳实验条件下对小檗碱或药根碱的PS-RTP和PS-RTF光谱进行测量，结果列于表1.小檗碱和药根碱的RTF光谱见图3，小檗碱的RTP光谱见图4.由图可见，两个化合物由于结构接近，光谱非常相似.小檗碱的磷光发射光谱则有两个峰，分别在522 nm和619 nm，stokes位移达269 nm，第一个发射峰为小檗碱的延迟荧光.该延迟荧光来源于从第一激发三重态T1重新生成的S1态的辐射跃迁.小檗碱的荧光发射峰在524 nm，stokes位移为174 nm，远小于磷光光谱的stokes位移.同样实验条件下，没有观察到药根碱的PS-RTP发射.

图3 小檗碱和药根碱的RTF光谱

图4 小檗碱的RTP光谱

表1 小檗碱或药根碱的PS-RTP和PS-RTF光谱参数

2.3 荧光偏振及磷光寿命的测量

磷光寿命的研究可提供磷光体与固体基质之间相互作用的机理和三线态的失活几率等微环境信息.固定小檗碱的最大激发和发射波长，考察了小檗碱的固体基质室温磷光寿命，可达36.5 ms.在纯水介质中小檗碱和药根碱的荧光偏振分别为0.216和0.133.小檗碱荧光偏振比较大，可能是其寿命由于其本身平面性较好，在溶液中分子运动速度较慢所致.

3 结论

采用荧光、磷光和紫外可见吸收光谱法，在溶液中和固体基质上，详细考察了小檗碱和药根碱的发光光谱行为.结果表明，小檗碱在慢速定量滤纸上既能产生荧光也能产生磷光，但药根碱只有荧光发射.由此推测，虽然药根碱与小檗碱的结构非常相似，但是微小的结构差别依然可以在磷光的产生中得到明显体现.利用此特点，可以提高分析小檗碱含量的选择性.

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