单细胞聚团拟胚体形成诱导人多能干细胞造血分化的技术优化

徐鉴城 段永娟 孙 仪 杨 洋 胡 晓

中国医学科学院血液学研究所 血液病医院实验血液学国家重点实验室，天津 300020

造血干细胞移植是治疗许多血液系统疾病的最有效的方法，但由于造血干细胞来源有限，在临床治疗应用中受到了极大的限制[1-3]。利用多能干细胞体外诱导造血分化获得造血干细胞是解决这一难题的方法之一[4-5]。 胚胎干细胞（ESC）是指从早期未分化的胚胎内细胞团中获得的一类多能干细胞。在体外培养过程中，具有无限增殖、自我更新和多向分化等特性。在体外能够分化为除胎盘以外的几乎全部成体组织细胞类型[6-8]，因而成为研究从多能干细胞获得包括造血干细胞在内的组织细胞的重要工具[9-10]。

在诱导多能干细胞分化的多种技术之中，利用拟胚体形成（embryoid body，EB）是一类重要的方法[11-12]。与传统的基质细胞共培养诱导分化相比[13-14]，EB 形成诱导分化具有多种优势。 包括易于扩大培养规模，可明确培养基成分易于培养的标准化，采用单细胞离心聚团形成的EB[单细胞聚团拟胚体（Spin-EB）]还具有可控细胞数目并进行外源基因导入等操作的优势，逐渐成为这一方法的技术主导。 在实际应用中，这一技术受多种因素的影响， 包括EB 形成的培养介质，细胞因子组合及EB 形成细胞数量及分化时间等。 因此，本研究旨在比较商业化的AggreWellTM800 培养板及普通V-96 孔培养皿，以及不同的细胞数量对于多能干细胞形成的EB 效率及进一步造血分化效率的影响，优化多能干细胞造血分化条件，为实现规模化标准化获得优质的造血干祖细胞提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

H1ES 和IPS 细胞系由中科院广州生命健康研究所潘光锦实验室惠赠。 mTeSR1 培养基、Dispase 消化液、Accutase 消化液、AggreWellTM800 培养板、H4435、H4436（Stem Cell 公司），StemlineⅡ培养基（Sigma 公司），双抗（Gibco 公司），ROCK 抑制剂（Y27632）（R&D公司）， 骨形成蛋白-4 （BMP4）、 血管内皮生长因子（VEGF）和碱性成纤维生长因子（bFGF）（Peprotech 公司），流式抗体鼠抗人CD34-APC、鼠抗人CD71-PE、鼠抗人CD235a-APC （eBiosciences 公司），V-96 孔板和低吸附24 孔板 （康宁公司）。 倒置显微镜（Nikon TS100）（日本尼康公司），流式细胞分析所用的仪器为Canto Ⅱ （美 国BD 公 司）， 台 式 离 心 机（centrifuge5810R）（Eppendorf 公司）。

1.2 AggreWellTM800 中拟胚体的形成

将P60 至81 代用mTeSR1 无基质细胞培养的H1ESC 集落用Accutase 消化液消化为单细胞，计数，按每个AggreWellTM800 培养板孔中加入1×106个细胞，加入EB 形成培养基，EB 形成培养基为加入50 ng/mL的BMP4、VEGF 和Y27632 的StemlineⅡ。按产品使用操作手册，将AggreWellTM800 培养板低速离心700 r/min，5 min，放入20%CO2，5%O2低氧培养箱中培养。 48 h后将形成的EB 转移至低吸附24 孔板中进行形态观察，EB 计数和诱导造血分化。

1.3 V-96 孔板中拟胚体的形成

ESC 的培养及细胞处理同上。 细胞计数后，重悬于EB 形成培养基，分三组在V-96 孔板中加入细胞。第1 组每个孔中加入3000 个细胞， 第2组每个孔中加入6000 个细胞， 第3 组每个孔加入9000 个细胞，低速离心700 r/min，5 min， 放入20%CO2，5%O2低氧培养箱中培养。 48 h 后将形成的EB 转移至低吸附24孔板中进行形态观察，EB 计数和诱导造血分化。

1.4 Spin-EB 的造血分化诱导

将两种培养介质形成的Spin-EB 重悬于造血分化培养基，加入低吸附24 孔板中。造血分化培养基为加入50 ng/mL 的BMP4 和VEGF，20 ng/mL 的bFGF的StemlineⅡ。放入20%CO2，5%O2低氧培养箱中培养。连续培养5 d，并于第3 天补充新鲜造血分化培养基。

1.5 造血分化Spin-EB CD34+检测

将上述条件形成的Spin-EB 经造血分化培养后收集， 加入胰蛋白酶消化为单细胞。 将适量单个细胞悬浮溶于100 μL PBS 中， 加入鼠抗人单克隆抗体：anti-CD34-APC。室温避光孵育15 min，2 mL PBS 洗1次，400 μL PBS 重悬细胞，BD CantoⅡ流式细胞仪检测CD34+细胞的比例，用FlowJo 7.6 软件分析流式检测结果。

1.6 集落形成实验

将造血分化诱导后的EB 消化为单个细胞，计数2×104～5×104个接种于H4435 培养基中，培养14 d，观察造血集落形态。

1.7 红系分化实验

将造血分化诱导后的EB 消化为单个细胞，取3×105个细胞进行红系诱导分化。 具体培养方法参见文献[15-17]。

2 结果

2.1 两种培养方式下形成的Spin-EB 数量与形态比较

将在AggreWellTM800 及V-96 孔板上形成的EB分别收集后计数并在光学显微镜下进行形态观察。AggreWellTM800 培养板每一培养孔中有300 个EB 形成小室，形成的EB 效率＞90%，且形成的EB 大小均匀，形态较为均一（图1A）。 在V-96 孔板中按照每孔加入3000、6000、9000 个细胞 （V-3000、V-6000、V-9000），EB 大小受加入的细胞数影响， 且大小和形态上不均匀，EB 形成效率分别为63%，31%和89%（图1B～E）。

图1 AggreWell Spin-EB 照片及V-96 孔板Spin-EB 形态及形成效率

2.2 Spin-EB 诱导造血分化后CD34+细胞的比例

将上述两种培养介质中形成的Spin-EB 转入低吸附24 孔板，并加入诱导造血分化的细胞因子组合，诱导分化培养5 d 后， 光学显微镜下观察分化EB 的形态特征并收集EB 消化为单细胞后流式分析CD34+细胞比例。结果显示，AggreWellTM800 培养板中形成的Spin-EB 中诱导造血分化后EB 呈分化良好的三维囊状空泡，CD34+细胞的比例为22.6%（图2A）；V-96 孔板形成的Spin-EB 中， 除3000 个细胞/孔的EB 中有部分分化良好的三维囊状空泡形态，6000、9000 细胞/孔的EB 均呈现为分化不良的实心结构。CD34+分析，3000 个细胞/孔为10.8%、6000 个细胞/孔为1.28%、9000 个细胞/孔为1.23%（图2B～D）。

图2 Spin-EB 造血分化诱导培养后形态及CD34+细胞比例

2.3 Spin-EB 来源CD34+造血集落形成和红系分化能力

为证明上述Spin-EB 来源的CD34+细胞具有造血分化能力，将造血分化诱导第5 天的EB 消化为单细胞后分别加入造血集落形成半固体培养基，以及红细胞分化诱导培养基。 图3A 所示， 以脐带血UCBCD34+造血集落作为对照，Spin-EB 来源的CD34+细胞所形成的BFU-E，CFU-G 和CFU-G 三种集落的形态与UCB 形成的此三种集落相似； 红系诱导分化培养10 d 后收集细胞经流式细胞仪分析发现， 细胞培养中有26%的细胞表达红细胞标志抗原CD71 和CD235a， 说明Spin-EB 来源的CD34+具有形成造血集落和向红系分化的能力。 见图3。

3 讨论

图3 Spin-EB CD34+的造血集落及红系分化能力

ESC 能够无限增殖和多向分化的能力多年来一直都是生物医学研究的重点， 其中ESC 在体外诱导分化为成熟类型细胞更是重中之重。通过诱导其向造血细胞分化，是有效解决临床治疗中造血干细胞短缺的有效方法之一。通过研究其向特定细胞分化的过程可以帮助建立疾病模型， 用于研究疾病的发病机制，可以帮助开发治疗方案，也可以研究生物体在发育过程中基因的表达调控等复杂的生理过程[18-20]。EB 的形成是ESC 进行体外诱导分化的关键步骤之一， 悬滴法和基质细胞共培养法是形成EB 的常规方法，但这两种方法都十分不利于进行外源基因转染等分子生物学方面的操作，难以进行分子水平上的研究。 本研究采用将ESC 消化为单细胞进行EB 培养的方法，此培养方法不仅培养基成分明确，而且能准确地掌握细胞数，同时也方便进行分子生物学方面的操作。

AggreWellTM800 培养板是StemCell 公司生产的可用于单细胞法培养EB 的培养板，本研究中采用的是AggreWellTM800 型，每个培养孔有300 个小孔。在每个孔中加入1×106个ESC 时， 每个小孔中大约有3000个细胞；V-96 孔板是一种普通的可用于酶联免疫研究的培养板，其与AggreWell 培养板相比具有相似的空间形态，因此在用V-96 孔板进行EB 培养时，从每孔3000 个细胞为起始， 同时设置6000 和9000 个细胞组。 从形态上看AggreWellTM800 培养板中形成的EB，经过在低吸附24 孔板中再培养5 d 后，不仅数量多而且发育更为成熟，经过同样的培养，V-96 孔板中3000 个细胞形成的EB 在大小上与AggreWellTM800培养板中形成的EB 最为相似，但是没有形成明显的囊状EB，9000 个细胞形成的EB 虽然形成率较高，但是分化效率较低。 流式细胞仪分析结果显示，AggreWellTM800 培养板形成的EB CD34+细胞的比例达到了22.6%，V-96 孔板中3000 个细胞组形成的EB CD34+细胞的比例是V-96 孔板中形成的EB 中最高的，比例为10.8%。根据流式结果选择AggreWellTM800培养板中形成的EB 进行造血集落形成和红系诱导分化实验，其BFU-E，CFU-G 和CFU-GM 三种集落的形态与对照组UCB 形成的集落形态相似； 经红系诱导分化， 有26.1%的细胞表达红细胞标志抗原CD71 和CD235a。 同时，在AggreWellTM800 培养板中用IPS 细胞进行试验， 经过相同的培养时间，IPS 形成的EB CD34+细胞阳性率为38.2%。

综上所述，利用商品化的AggreWellTM800 培养板可以较高效率地形成EB 并诱导造血分化， 但是AggreWellTM800 培养板的缺点在于价格比较昂贵， 不利于进行大规模实验， 相比之下V-96 孔板虽然在EB形成效率和分化上不及AggreWellTM800 培养板组，但是V-96 孔板价格十分便宜， 尤其适合大规模实验，因此V-96 孔板中形成EB 的体系也十分值得进一步优化。

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