α-半乳糖苷酶对生长猪生长性能及营养物质体内外消化率的影响

陈轶群，杨雯涵，郭晓晶，韩帅娟，杨勇智，曹云鹤

(中国农业大学，动物营养学国家重点实验室，北京 100193)

α-半乳糖苷酶对生长猪生长性能及营养物质体内外消化率的影响

陈轶群，杨雯涵，郭晓晶，韩帅娟，杨勇智，曹云鹤*

(中国农业大学，动物营养学国家重点实验室，北京 100193)

本试验旨在探讨日粮不同α-半乳糖苷酶添加水平对生长猪生长性能和营养物质表观消化率的影响，并研究仿生酶法对酶制剂评价试验的准确性。试验选用180头生长猪(杜×长×大)，试验初始体重为(18.45± 2.00)kg，按照随机区组试验设计，分为5个处理，每个处理6个重复，每个重复6头猪(公、母各半)。日粮α-半乳糖苷酶添加量为0、100、200、300、400 U/kg，试验期为24 d。仿生酶法使用相同处理，每个处理5个重复，每个重复1根模拟消化管。结果表明:相对于其他处理组，添加300 U/kg α-半乳糖苷酶显著提高了平均日采食量和平均日增重(P＜0.05);随着-半乳糖苷酶添加量的增加，大部分营养物质的体内外消化率呈二次提高(P＜0.05);仿生酶法的消化率与体内消化率高度相关。本试验证明，18～33 kg生长猪的该-半乳糖苷酶最适宜添加水平为300 U/kg，且仿生酶法可准确预测体内消化率，用于酶制剂的体外评价试验。

-半乳糖苷酶;猪;生产性能;消化率;仿生消化酶法

大豆和豆粕是单胃动物饲料中使用最广泛的植物性蛋白原料。然而,大豆及其加工产品中的寡糖,即大豆寡糖,包括蜜二糖、棉籽糖和水苏糖,其抗营养作用经常被忽视［1］。后2种寡糖是在1个蔗糖的基础上通过-1,6-糖苷键连接1个和2个-D-半乳糖而得到的［2］。豆粕中这3种糖的含量因大豆品种、产地和加工工艺等因素而略有不同,美国豆粕中蔗糖、棉籽糖和水苏糖的平均含量分别约为65.8、11.8、49.8 g/kg干物质［3］。这些寡糖在后肠段被微生物发酵后会引起胀气和动物不适,并降低其他营养物质的消化率［4］。然而,物理或化学加工方法如加热、浸泡、去皮和乙醇浸提不能完全消除大豆寡糖［5-7］。

因此,本试验使用毕赤酵母表达工程菌株进行100 L发酵罐高密度发酵后,制成-半乳糖苷酶样品。旨在研究18～33 kg生长猪玉米-豆粕型日粮中,添加-半乳糖苷酶对生长性能和营养物质体内外消化率的影响,以确定饲料中合适的添加量,并验证体外消化法对酶制剂评价的准确性。

1 材料与方法

1.1 试验材料 除特别注明者外,所有试剂均为分析纯。本试验所使用的-半乳糖苷酶来源于本实验室分离的扬奇青霉,经毕赤酵母表达制得。发酵液于4℃,7 000 r/min离心5 min,上清液于4℃保存。酶样品由发酵上清液吸附于细麸皮上,自然风干制得。吸附后样品酶活为400 U/g,酶活的测定方法参考Chen等［15］。其他材料参考杨雯涵等［16］体外消化试验测定方法。

1.2 试验设计和日粮 选取180头初始体重为(18.45±2.00)kg的杜×长×大三元杂交生长猪,按照随机区组试验设计分为5个处理,每个处理6个重复,每圈为1个重复,每个重复6头猪,公、母各半,试验期为24 d。基础日粮配制参照NRC标准,基础日粮类型为玉米-豆粕型日粮,5个处理分别在基础日粮中添加终浓度为0、100、200、300、400 U/kg的-半乳糖苷酶。采用三氧化二铬为指示剂。日粮配方和各处理营养成分见表1。体外试验使用SDS-Ⅱ单胃动物仿生消化系统,每个处理5个重复,每个重复1根模拟消化管。

1.3 试验动物与饲养管理 本试验在国家饲料工程技术研究中心/农业部饲料工业中心动物试验基地(河北丰宁)进行。试验用猪品种为杜×长×大三元杂交。采用全进全出饲养管理模式,猪舍温度控制在18～20℃,自然光照。每圈(2.0 m×2.5 m)均配有1个乳头式饮水器和1个料槽。圈舍为半水泥半漏缝地板,试验采用粉料饲喂,自由采食和饮水。按照猪场常规管理程序进行免疫和消毒。

1.4 体外消化率测定方法 参考杨雯涵等［16］的方法。

1.5 测定指标与方法

1.5.1 生长性能与样品采集 于试验0、12、24 d称猪和饲料重量,计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和耗料增重比(F∶G)。在试验的10～12 d和22～24 d,从每圈采集新鲜粪便,保存于-20℃,将3 d的粪样混匀后,在60℃烘箱内烘72 h至干燥。

1.5.2 日粮和粪便成分及营养物质消化率 试验日粮和粪样取样,粉碎过40目筛,参考AOAC方法测定饲料样品与粪样中干物质(DM)、粗蛋白质(CP)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、钙(Ca)和总磷(TP)含量。使用全自动氧弹量热仪(Parr 6300,美国)测定饲料与粪中总能(GE)。用原子吸收分光光度法测定饲料与粪中铬的含量(日立Z-2000原子吸收分光光度计,日本)。

表 日粮配方与营养成分

表 日粮配方与营养成分

注∶①每千克饲料中由预混料提供∶维生素A 5 512 IU,维生素D32 200 IU,维生素E 30 IU,维生素K32.2 mg,维生素B1227.6 μg,维生素B24 mg,泛酸14 mg,烟酸30 mg,氯化胆碱400 mg,叶酸0.7 mg,维生素B11.5 mg,维生素 B63 mg,生物素 44 μg;锰(MnO)40 mg,铁(FeSO4·H2O)75 mg,锌(ZnO)75 mg,铜(CnSO4·5H2O)100 mg,碘(KI)0.3 mg,硒(Na2SeO3)0.3 mg。②除消化能外,其他值均为实测值

项目 α-半乳糖苷酶添加量/(U·kg-1) 0 100 200 300 400日粮组成/%玉米 67.04 67.04 67.04 67.04 67.04豆粕 25.40 25.40 25.40 25.40 25.40小麦麸 4.13 4.11 4.08 4.06 4.03石粉 0.87 0.87 0.87 0.87 0.87磷酸氢钙 1.10 1.10 1.10 1.10 1.10食盐 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 L-赖氨酸盐酸盐 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05氯化胆碱 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20肽生素 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01三氧化二铬 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30预混料① 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50毒去完 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05酶样 0.00 0.03 0.05 0.08 0.10合计 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00营养成分②干物质/% 88.21 87.38 87.30 87.57 87.32粗蛋白质/% 18.25 18.54 18.51 18.27 18.61消化能/(MJ·kg-1) 14.21 14.21 14.21 14.21 14.21赖氨酸/% 0.95 0.98 0.97 0.98 0.96蛋氨酸/% 0.30 0.29 0.30 0.30 0.29苏氨酸/% 0.70 0.73 0.70 0.75 0.71色氨酸/% 0.20 0.20 0.21 0.20 0.20钙/% 0.70 0.73 0.72 0.69 0.68总磷/% 0.58 0.62 0.59 0.60 0.58 α-半乳糖苷酶活性/(U·kg-1) 0.6 95.3 198.6 287.2 389.6寡糖/(mg·g-1)蔗糖 5.57 5.56 5.53 5.57 5.52棉籽糖 0.65 0.66 0.65 0.64 0.65水苏糖 1.42 1.43 1.42 1.41 1.44

日粮中氨基酸测定样品粉碎过60目筛。在6 N盐酸中,氮气环境下110℃酸水解24 h,用氨基酸分析仪测定(日立L-8900,日本)。含硫氨基酸使用氧化水解方法测定。色氨酸经过4 N氢氧化锂碱水解,使用高效液相色谱测定(安捷伦1200,美国)。

日粮中寡糖含量测定∶称取0.5 g样品,先加入20 mL无水乙醇,振荡混匀,接着加入30 mL 80%甲醇(v/v),磁力搅拌1 h。上清液8 000 r/min离心5 min,取1 mL定容于50 mL容量瓶中,0.22 μm滤膜过滤,用于离子色谱测定(戴安ICS-3000,美国)。色谱分析采用250 mm×4 mm分析柱,使用120 mmol/L NaOH洗脱,流速为1.0 mL/min。

使用指示剂法测定营养物质表观消化率(ATTD)。公式如下∶

ATTD(%)=［1-(NCfeces/NCdiet)×(Crdiet/Crfeces)］×100其中,NCfeces是粪中营养物质浓度(%),NCdiet是饲料中营养物质浓度(%),Crdiet是饲料中三氧化二铬的浓度(%),Crfeces是粪中三氧化二铬的浓度(%)。

体外消化率计算公式如下∶

营养物质消化率(%)=100-(消化残渣重量×消化残渣营养物质含量)/(试样上样重量×试样营养物质含量)×100

饲料酶水解物能值EHGE(MJ/kg)=(上样饲料总能残渣总能)/上样饲料干物质量(g)/1000

1.6 统计分析 所有数据以重复为统计单位,采用SAS统计软件中GLM模型,以ANOVA方法进行分析。采用线性及二次比较分析来评价梯度添加外源酶的作用效果。结果用最小二乘法的均值±平均标准误表示,P＜0.05为差异显著。

2 结 果

2.1 日粮不同α-半乳糖苷酶添加量对生长猪生长性能的影响 试验期间猪群总体健康状况良好。由表2可知,当添加量大于200 U/kg时,12、24 d的体重显著提高,添加量为300 U/kg时体重为最大值(P＜0.05)。此外,添加300 U/kg的α-半乳糖苷酶还可显著提高1～12 d的平均日采食量(P＜0.05)和平均日增重(线性,P＜0.05),以及1～24 d的平均日采食量和平均日增重(P＜0.05);但添加不同水平的α-半乳糖苷酶对13～24 d的生长性能没有显著影响。

2.2 日粮不同α-半乳糖苷酶添加量对生长猪营养物质表观消化率的影响 由表3可知,除了酸性洗涤纤维和钙,日粮中添加100～300 U/kg的α-半乳糖苷酶均可显著提高1～12 d其他常规指标的消化率(线性,P＜0.05;二次,P＜0.05);但在13～24 d,只有200～300 U/kg的添加量可显著提高除钙以外其他指标的消化率(二次,P＜0.05)。

表2 日粮不同α-半乳糖苷酶添加量对生长猪生长性能的影响

表3 日粮不同α-半乳糖苷酶添加量对生长猪营养物质表观消化率的影响 %

2.4 体内外消化率的相关性 从表5可以看出,能量、粗蛋白质和中性洗涤纤维的体内外消化率相关系数都在0.9以上(P＜0.05),表明2种测定方法上述指标的相关性很高;且体内能量消化率与干物质、粗蛋白质和中性洗涤纤维的体外消化率高度相关。由体外消化率推测体内消化率的方程见表6。

3 讨 论

Gdala等［12］应用瓣后盲肠T-型瘘管法、以体重约为20 kg的猪为研究研究对象,结果表明,各品种羽扇豆日粮中添加7 500 U/kg的-半乳糖苷酶均可提高约2%的回肠末端干物质和能量消化率;蛋白质的消化率变化不显著,但大部分氨基酸的消化率提高了。43～94 kg生长育肥猪日粮中添加200 U/kg的-半乳糖苷酶能显著提高育肥期全消化道干物质和粗蛋白质的消化率,并有提高中性洗涤纤维消化率的趋势［2］。本试验中200～300 U/kg的添加量可显著提高大部分营养物质的表观消化率。由此可知,添加-半乳糖苷酶对日粮营养物质消化率的影响受日粮类型、猪的生长阶段及添加量等多种因素的制约。

表4 日粮不同α-半乳糖苷酶添加量对营养物质体外消化率和能值的影响

表5 不同营养物质体内外消化率的相关性

表6 体内消化率的预测方程 %

本试验中,日粮蔗糖、棉籽糖和水苏糖的含量分别为5.57、0.65、1.42 mg/g,换算成豆粕中的含量约为21.93、2.56、5.59 mg/g,明显低于报道中的含量(约59.2、10.6、44.8 mg/g)［3］,这可能是本试验仅添加300 U/kg的-半乳糖苷酶就对生长性能和营养物质消化率提升较显著的原因。日粮添加-半乳糖苷酶能显著提高棉籽糖和水苏糖的回肠末端消化率,但这2种糖在后端肠道中几乎全部被微生物降解［12］,这与本试验的结果相同(数据未显示)。因此,粪消化率不能反映日粮中大豆寡糖在小肠内的降解情况,本试验-半乳糖苷酶的添加对日粮大豆寡糖的降解效果还需进一步验证。

陈亮［18］研究结果证明,仿生酶法测定的干物质、能量和粗蛋白质的消化率比体内法低,干物质、有机物、能量和粗蛋白质的消化率与体内消化率高度相关,且能量和粗蛋白质的准确性比体内法更高,这与本试验的结果一致。李岩岩［19］用仿生酶法评价了小麦日粮添加木聚糖酶的效果,发现在酶的最高剂量时干物质消化率最低,这与本研究高剂量酶呈现的消化率下降一致,可能是由于高浓度酶的反馈抑制造成的;同时只有干物质和粗蛋白质的体外消化率与体内法高度相关,说明体外法的准确性受日粮组成的影响。

4 结论

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Effects of Dietary α-galactosidase on Performance of Growing Pigs and Nutrient Digestibility in vivo and in vitro

CHEN Yi-qun,YANG Wen-han,GUO Xiao-jing,HAN Shuai-juan,YANG Yong-zhi,CAO Yun-he*
(Ministry of Agriculture Feed Industry Centre,China Agricultural University,Beijing 100193,China)

The objective of this study was to demonstratie the effects of-galactosidase supplementation on performance and nutrient digestibility in vivo and in vitro of growing pigs,and accuracy of simulative digestion method on enzyme evaluation trails.A total of 180 crossbred pigs(Duroc×Landrace×Large White),weighing 18.45±2.00 kg,were assigned to one of five treatments using a complete randomized block design.Each treatment contained six pens(three male pens and three female pens)with six pigs per pen.The experiment lasted for 24 days.A basal diet was formulated on the basis of corn and soybean meal and the other four experimental diets were identical to the basal diet with the exception that 100,200,300 or 400 U/kg of-galactosidase was included in these diets.The simulative digestion method used the same diets above with five replicates per treatment.Addition of 300 U/kg of-galactosidase increased average daily gain and average daily feed intake (P＜0.05),and nutrient digestibility both in vivo and in vitro showed a quadratic increase (P＜0.05)as increasing-galactosidase supplementation.Digestibility measured by simulative digestion was highly correlated with in vivo digestibility.It is concluded that 300 U/kg of-galactosidase would be optimum for growing pigs and simulative digestion method is potential for feed enzyme evaluation.

-galactosidase;pig;growth performance;nutrient digestibility;simulative digestion

S828.5

A文献标识码:0258-7033(2015)11-0038-06

2014-09-16;

2014-11-02

国家863计划项目(2012AA022208);国家科技支撑计划项目(2013BAD10B01)

陈轶群(1985-),男,辽宁丹东人,动物营养学博士

*通讯作者:曹云鹤,E-mail:Caoyh@can.edn.cn