沉默α的RNAi转基因小鼠干扰效果及其繁殖性能的分析

汪加兴，贾启涛，李帅峰，梁爱心，杨利国，张淑君

(华中农业大学动物科技学院，农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，湖北武汉 430070)

汪加兴，贾启涛，李帅峰，梁爱心，杨利国，张淑君*

(华中农业大学动物科技学院，农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，湖北武汉 430070)

抑制素(INH)主要是通过抑制促卵泡素(FSH)的合成与分泌来调节卵泡发育和精子发生，而INHα是其重要组成亚基。本实验室前期将α基因3个RNAi片段(分别命名为B、C和M)整合到小鼠基因组中得到了转基因小鼠;本研究分析这3个RNAi片段在转基因雌鼠中的抑制效果及对繁殖性能的影响。结果表明:B、C和M片段在转基因雌鼠F3代中遗传率分别为81.3%、51.1%和77.6%，其3周时抑制效率分别为27.5%、96.1%和75.1%;转基因雌鼠F0代的第1胎产仔数均高于野生型，而F1、F2代B和M片段升高，C片段减少，但差异不显著(＜0.05)，此外其F2代3周子鼠卵巢重和体重显著高于野生型(＜0.05)。综上，INH是体内必需的重要调控基因，不能缺少，过多抑制反而会降低其繁殖性能;遗传稳定性可能随着干扰抑制效率的提高而降低。

INHα;RNAi;卵泡发育;转基因小鼠

抑制素(INH)作为一种糖蛋白激素,是转化生长因子β(TGF-β)超家族的成员,该家族参与体内各种细胞发育和分化功能的调节［1］。抑制素INH由2个不同的亚单位即α亚基和β亚基经二硫键连接而形成异源二聚体,而β亚基又分为βA和βB 2种形式,故抑制素有抑制素A(αβA)和抑制素B(αβB)2种形式。雄性体内,抑制素能抑制精原细胞的生成并减少精原细胞的数量,降低精液生成量［2］;雌性体内,抑制素对维持卵泡的正常发育非常重要［3］。此外,INH还参与胚胎发育［4］、肿瘤［5-7］等生理过程的调控。

RNAi即RNA干扰,是指将外源双链RNA导入细胞后引起与其序列同源的特异基因mRNA降解的现象,属于转录后基因沉默的一种形式［8］。Han等［9］利用RNAi技术对小鼠垂体前叶细胞进行了α基因的沉默,发现沉默INH影响了细胞的增殖、凋亡等生命活动。

外源片段导入有多种方法,本实验通过显微注射的方法将干扰抑制素基因的RNAi片段导入到小鼠体内,成功获得了不同干扰片段(分别命名为B、C和M)的转基因小鼠。通过分析α基因RNAi转基因小鼠的siRNA干扰抑制效应及其对生殖器官和繁殖性状的影响,为进一步研究抑制素基因功能和应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验中使用的小鼠是FVB型小鼠,转基因阳性小鼠由广州赛业生物有限公司通过显微注射的方式获得。接收转基因小鼠后在恒温条件下(20～25℃)和湿度(60%～75%)条件下进行单间饲养管理,提供12 h光照/黑暗的光照周期。

1.2 实验小鼠繁育 对后期实验所需的小鼠均采用自繁。设计不同干扰水平阳性小鼠之间配种,每个实验组6～7窝,分析与野生型小鼠之间在产仔数、初生重、存活率等方面的差异。每个鼠笼里放置一公一母,3 d换1次水,7 d换1次垫料;母鼠产仔后将雄鼠分开,统计产仔数、出生重等数据,21 d后子鼠断奶后重新与雄鼠合笼。

1.3 转基因小鼠后代阳性检测 母鼠哺乳21 d后剪子鼠尾巴2～3 cm,采用传统DNA提取法提取基因组DNA。所提的DNA利用PCR的方法来检测是否为阳性。所需要的PCR引物序列及相关参数见表1。

1.4 RNA提取和实时荧光定量PCR 利用Trizol试剂(Vitrogen)根据说明书从经PCR检测为阳性的3周和6周雌鼠卵巢中分离卵巢总RNA,采用RT-PCR法合成cDNA以及使用SYBR Green(SYBR Green实时荧光定量PCR预混QPK-201,日本东洋纺公司)进行实时定量PCR。特异性QPCR在罗氏480实时荧光定量PCR系统中进行。实时QPCR反应后,样品通过熔解曲线的分析以验证PCR产物的纯度。QPCR引物及相关参数见表2,测定每个样品中目的基因mRNA和管家基因ACTB的CT值。各基因的相对mRNA表达水平使用下式估算∶2-ΔΔCT［10］。

表1 转基因阳性后代小鼠检测引物序列及相关参数

表2 qPCR相关引物及参数

1.5 统计分析 所有数据采用单因素方差分析。利用SPASS统计分析系统对所有数据进行分析。P＜0.05的值被认为是显著。结果均以平均值±标准差表示(n≥3)。

2 结 果

2.1 转基因雌性小鼠的RNAi干扰片段的检测及遗传率分析 采用PCR技术检测转基因小鼠后代中的RNAi干扰片段(图1),3个RNAi干扰片段均能够遗传给下一代。不同的干扰片段在后代中的遗传存在差异,3个片段在后代中的阳性率为B＞M＞C(P＞0.05,图2)。

图1 转基因后代子鼠阳性PCR检测

图2 F3代不同干扰片段在转基因小鼠中遗传稳定性的分析

2.2 转基因雌性小鼠的产仔数、初生重与3周龄体重的分析 通过统计和分析不同片段转基因小鼠连续3代第1胎产仔数。与野生型小鼠相比,转基因小鼠后代的产仔数得到提高,但差异不显著,并且表现为B和M片段在F1、F2代有所增加而C片段反而降低(P＞0.05,表3)。此外,转基因小鼠后代出生平均体重相对于野生型均有所提高,其中M片段的转基因小鼠后代显著提高平均出生体重(P＜0.05)。此外,B片段和M片段F3代转基因小鼠分别极显著(P＜0.01)和显著(P＜0.05)提高了3周体重(表4)。

2.3 转基因雌性小鼠的卵巢重量的分析 对转基因小鼠F3代雌鼠3周卵巢发育进行分析,转基因小鼠的卵巢重量均有所提高,其中B和M片段转基因小鼠极显著提高了卵巢重量,并且卵巢增长高低顺序为B＞M＞C,这与RNAi干扰效率相反(P＜0.01,表4)。

2.4 转基因雌性小鼠卵巢中促卵泡素受体FSHR基因mRNA表达水平的分析 利用qPCR技术检测转基因雌性小鼠卵巢中的FSHR基因mRNA表达水平,与野生型相比,3周龄转基因雌性小鼠的FSHR基因mRNA表达水平显著下降(P＜0.05);6周龄时则有所上升,其中B片段转基因小鼠FSHR上升水平相对于C、M片段较高(图3)。

表3 连续3代转基因阳性雌性小鼠第1胎产仔数(每组平均2～4窝)

表4 F3代雌鼠3周体重、卵巢重数据(n=4)

图3 F3代3～6周转基因雌性小鼠的FSHR和6周龄时ERβ基因mRNA表达水平

3 讨 论

图4 F3代不同周龄转基因阳性雌鼠抑制素α基因的表达

3.1 转基因雌性小鼠的RNAi干扰片段的遗传稳定性 RNAi技术作为一种新型研究基因功能、干扰劣势或不利基因表达的技术,得到了广泛应用。Stein等［10］将Mos基因的RNAi显微注射到小鼠成熟的卵母细胞中,导致了Mos基因的特异降解。将特异性敲除抑制素-α基因的RNAi注射到小鼠体内获得了转基因小鼠。研究表明,干扰片段可以稳定遗传给下一代。Shi等［11］通过睾丸注射的方法,将构建的以sp3111为靶基因的转基因RNAi载体注射到雄性小鼠睾丸中,30 d后与野生雌性小鼠交配获得了sp3111基因表达量降低的转基因子鼠［12］。

本实验中该干扰片段均遗传率达到了50%～80%,单胎遗传率甚至出现100%。出现这种现象是由于配子产生过程中经历2次减数分裂,并且存在同源重组现象等造成后代配子中不存在RNAi片段,从而出现阴性小鼠。对于异源杂交对RNAi稳定遗传的影响需进一步分析研究。此外,干扰片段干扰效率与其遗传稳定性存在一定的关系,表现为高干扰效果的片段反而具有较低的遗传稳定性,这可能是由于插入基因组内的外源片段拷贝数较多,在形成配子过程中引起体内自身的基因组保护机制,从而降低其遗传性。

3.2 抑制素-α基因的RNAi片段转基因雌性小鼠卵泡发育加快及体重的提高 雌性动物3周断奶后进入卵泡发育阶段,到6周时达到性成熟。FSH是促进卵泡发育的一个非常重要的激素,而抑制素主要的作用是抑制FSH的合成与分泌来调节卵泡发育与精子发生,降低抑制素-α表达水平后促进了雌性小鼠卵巢的发育,表现为卵泡数增多,加快卵泡的成熟过程。其原因可能为在卵泡发育过程中前半期以激活素(ACT)作用为主,ACT促进FSH和LH受体表达,提高芳香化酶活性,导致FSH合成分泌增加［13］。而抑制素能够竞争性结合ACT结合受体ACTRⅡ,降低了ACT促FSH分泌的作用。RNAi发挥作用后降低了抑制素表达水平,造成对ACT竞争性抑制作用减弱,提高了FSH水平,提高了其促卵泡发育的能力,但3周FSHR水平显著下降,这其中机制需要进一步研究。此外,6周性成熟时期FSHR表达水平相对于野生型没有变化且与3周相比趋势有所上升,这可能与FSH和FSHR结合效率以及FSH对FSHR表达的反馈调节相关。此外,6周龄卵巢GC上雌激素受体(ERβ)显著下降,研究表明在卵泡发育后期ER主要形式为ER-β［14］,敲除ER-β的KO(Knockout)小鼠能正常发育、生长且与野生型无差异,但是表现为产仔数减少［15］,其原因可能是由于在排卵期低水平的ER降低了垂体对GnRH的敏感性导致LH分泌降低造成的。另外转基因小鼠后代产仔能力还可能与雄性精子品质等方面有关,其中具体机制需要对RNAi片段是否对LH存在影响以及对ER表达调控的机制做进一步深入分析。一定程度上降低抑制素的表达水平可以显著促进卵巢发育及体重的提高,而过多的降低抑制素的表达水平反而会降低其繁殖性能,表明抑制素是体内所必需的生殖激素之一。

因此,由于RNAi干扰抑制了抑制素-α基因而降低了抑制卵泡发育的功能,从而可能促进卵巢中颗粒细胞、卵母细胞生长发育,提高卵巢重量和卵巢发育。

4 结 论

特异性干扰抑制素α基因的RNAi片段成功导入到小鼠基因组内,并能较稳定地遗传;导入的RNAi片段发挥了干扰作用降低了抑制素-α基因的表达,从而促进了卵巢和卵泡的发育以及提高了小鼠的生长。

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Analysis of Interference Effects and Reproductive Performance of RNAi in INHα Silencing Transgenic Mice

WANG Jia-xing,JIA Qi-tao,LI Shuai-feng,LIANG Ai-xin,YANG Li-guo,ZHANG Shu-jun*
(Key Lab of Agricultural Animal Genetics,Breeding and Reproduction of Ministry of Education, Huazhong Agricultural University,Hubei Wuhan 430070,China)

The role of inhibin,transforming growth factor-β (TGF-β)superfamily member,is to regulate folliculardevelopment and spermatogenesis through the inhibition of synthesis and secretion of follicle-stimulating hormone.Our previous studies,three RNAi fragments interfering INHgene(named B,C and M)have integrated into mouse genome and got transgenic mice.This study analyzed the interference effects of three segments within the mouse genome and its effects on reproductive performance.The results showed that the genetic rates of B,C and M fragments in F3generation transgenic female mice were 81.3%,77.6%and 51.1%and inhibition efficiency of three-week were 27.5%,96.1%and 75.1%,respectively;On the first litter size,F0generation of transgenic female mice was higher than wild-type,and F1,F2generation of B and M segments increased,while C fragment reducted,both have no significant difference,in addition to the ovarian weight and body weight of three-week-age offspring in F2generation were significantly higher than that of wild-type.In conclusions,INH is an important regulatory gene in vivo which must not be missing,too much inhibition reduces the reproductive performance;genetic stability may decrease with the high interference efficiency.

INH α;RNAi;ovary development;transgenic mice

S865.1+30.3

A文献标识码:0258-7033(2015)11-0001-04

2014-10-21;

2014-12-27

黄鹤英才项目;欧盟F7项目(PIIF-GA-2012-328205、PIIFR-GA-2012-912205、FP7-KBBE-2013-7-613689)

汪加兴(1990-),男,硕士,主要从事动物遗传育种与繁殖研究,E-mail:wangjiaxingabcd@163.com

*通讯作者:张淑君,E-mail:sjxiaozhang@mail.hzan.edn.cn