番鸭CYP7A1基因多态性对肉质和血清生化指标的效应研究

张依裕，李万贵，王单单

(1.贵州大学动物科学学院，高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室，贵州贵阳 550025)

番鸭CYP7A1基因多态性对肉质和血清生化指标的效应研究

张依裕，李万贵，王单单

(1.贵州大学动物科学学院，高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室，贵州贵阳 550025)

CYP7A1是催化动物肝脏胆固醇转变成胆汁酸的限速酶。本研究采用PCR-SSCP法和DNA直接测序相结合筛查白羽番鸭CYP7A1基因多态性，分析其与肉质和血清生化指标的相关性。结果表明:在CYP7A1基因外显子2检测到沉默突变c.294.A＞G，产生3种基因型AA、AG和GG，AG和A分别为优势基因型和优势等位基因，其频率分别为0.5517和0.6107;在外显子3检测到沉默突变c.759.T＞A，TT和T分别为优势基因型和优势等位基因，其频率分别为0.6552和0.7931;2个SNP均为中度多态位点，且基因型分布均未偏离Hardy-Weinberg平衡。关联分析显示，c.294.A＞G突变对肉质和血清生化指标没有产生显著影响;c.759.T＞A突变对血清总胆固醇、总蛋白和白蛋白有显著效应，A为低血清总胆固醇的有利等位基因，可能作为降低番鸭胆固醇的一个标记性辅助选择位点。

番鸭;CYP7A1基因;SNP;肉质;血清生化指标

肝脏胆汁酸合成的代谢途径是一个精细的调控过程,它对膳食中脂质吸收和血清中的胆固醇调控是不可或缺的,在哺乳动物的进化中这一调控过程存在差异。胆固醇7a羟化酶(CYP7A1)在维持胆固醇体内平衡过程中扮演着重要角色,是催化肝脏胆固醇转变成胆汁酸的限速酶,在啮齿类动物和人类中,它的活性与血浆中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)呈负相关,并证实CYP7A1活性的下降导致血清LDL-C水平上升而引发动脉粥样硬化的风险［1］。CYP7A1功能的发挥主要受其转录水平的控制,受昼夜节律、生活压力、有害异物、胆固醇、胆汁酸等效应因子的调节,肝细胞核因子4α(HNF-4)、胎蛋白转录因子(FTF)、微小异源二聚体伴侣基因(SHP)、过氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子1α(PGC-1)等核激素受体共同参与了这一转录调控过程［2］。研究证明,大鼠中核激素受体肝X受体α(LXR)正向调控CYP7A1的表达量,而人类CYP7A1基因启动子区缺乏LXR结合位点而没有呈现出类似调控作用,这对研究胆固醇代谢的基因网络调控在物种进化中的差异有重要意义［3-4］。至目前为止,CYP7A1基因的研究主要集中在小鼠和人类上的研究报道,在家禽上的研究报道较少。为了进一步了解家禽CYP7A1基因的遗传效应,本研究以白羽番鸭为研究素材,采用PCRSSCP法结合DNA测序检测CYP7A1基因部分编码区的多态性,分析其多态对肉质和血清生化指标的影响,为今后开展番鸭的标记辅助选择育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料 同批出雏的白羽番鸭母鸭100只饲养于贵州大学动物科学学院金沙县水禽养殖基地,饲养管理水平一致,10周龄时随机抽取58只禁食12 h,自由饮水,心脏采血,自然凝固后分离血清用于生化指标测定,分离血清后的血液凝集物用于DNA提取,宰后取胸肌用于肉质测定。2×Taq Master Mix、TIANamp Blood DNA KIT试剂盒、二甲苯氰及其他常规试剂均购自恒因生物有限公司。

1.2 肉质和血清生化指标测定 采用Au5800型全自动生化分析仪(美国贝克曼仪器公司)测定总蛋白、白蛋白、球蛋白、甘油三酯和总胆固醇;胸肌采后即用张依裕等［5］报道的方法测定胸肌常规肉质指标pH值、失水率、嫩度和肌内脂肪(IMF)。

1.3 引物设计 根据家鸭CYP7A1基因mRNA序列(JQ922243)设计引物扩增白羽番鸭CYP7A1基因外显子2和3,引物信息见表1。

表 引物序列

表 引物序列

引物 序列(5′→3′) 扩增区域及片段大小/bp 退火温度/℃CYP2 F:AGG AGA GCC ACC ACT TGA AA 外显子,2165～324/160 58 R:GGG GTC AGT GAG GAA ATG AA CYP3-1 F:GGT AGC ATT GAC CCA GCA GA 外显子,3412～697/286 60 R:TCT CGG TTT CCT GCT TTG ATA CYP3-2 F:AGG AAA CCG AGA GAG CAC ATA T 外显子,3686～983/298 60 R:GTA GCA GGA ATG GTG TTA GC

1.4 基因组DNA提取 采用TIANamp Blood DNA KIT试剂盒提取所有白羽番鸭个体的基因组DNA, 0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测,核酸蛋白测定仪测定其浓度,调整其终浓度为100 ng/μL,-20℃保存备用。

1.5 PCR-SSCP分型 用设计的3对引物分别对目的片段进行PCR扩增,PCR反应总体积为20 μL∶2× Taq Master Mix 8 μL,dd H2O 9 μL,10 μmol/μL正、反向引物各1 μL,100 ng/μL DNA模板1 μL。PCR反应程度均为94℃预变性10 min;94℃变性45 s,退火30 s,72℃延伸45 s,共30个循环;72℃延伸5 min;4℃保存。PCR产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr∶Bis=29∶1)电泳进行检测。

移液枪取3 μL PCR扩增产物与6 μL上样缓冲液(98%甲酰胺、2%甘油、0.025%二甲苯青、0.025%溴酚蓝、5 mmol/L EDTA)混合,98℃变性15 min,-80℃放置3 min,电压150 V条件下在10%非变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr∶Bis=39∶1)上电泳8 h,银染显色,随机选取不同带型个体(3个)的PCR产物直接送上海生物工程有限公司进行双向测序。

1.6 统计分析 DNAMAN软件和人工较对相结合筛查SNP位点,PopGen v1.32软件计算基因型和等位基因频率、多态信息含量(PIC)和Hardy-Weinberg平衡检验。SPSS 17.0软件对位点基因型与各性状值间的关联性进行统计分析,Duncan′s法进行显著性差异检验,结果均以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 PCR-SSCP检测 通过对引物CYP2、CYP3-1和CYP3-2的扩增产物进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr∶Bis=29∶1)电泳检测,结果表明PCR产物片段大小与预期相符,条带清楚、单一,达到SSCP分型要求。通过SSCP分型,引物CYP3-1的扩增产物中没有检测到多态,引物CYP2和CYP3-2中均检测到3种带型,CYP2的带型定义为AA、AG和GG,CYP3-2的带型定义为TT、AT和AA,图谱见图1。

2.2 SNP筛查 通过DNAMAN软件和人工较对相结合筛查番鸭CYP7A1基因SNP位点,比对结果显示,在CYP2座位检测到1个SNP,位于家鸭CYP7A1基因mRNA序列(JQ922243)294位的A→G突变(c.294.A＞G),处于外显子2内,位于CDS区的216位,为沉默突变;在CYP3-2座位也检测到1个SNP,位于家鸭CYP7A1基因mRNA序列(JQ922243)759位的T→A突变(c.759.T＞A),该突变处于外显子3内,位于CDS区的681位,为沉默突变(见图2)。

图1 PCR-SSCP电泳图谱

图2 序列比对图

2.3 SNP位点基因型频率和等位基因频率 由表2可知,c.294.A＞G位点中AG和A分别为优势基因型和优势等位基因,其频率分别为0.5517和0.6107;c.759.T＞A位点中TT和T分别为优势基因型和优势等位基因,其频率分别为0.6552和0.7931;2个SNP位点均表现为中度多态位点,且基因型分布均未偏离Hardy-Weinberg平衡(＞0.05)。 2.4 SNP位点与番鸭肉质和血清生化指标关联性分析 由表3可知,c.294.A＞G位点对所测肉质和血清生化指标的影响没有达到显著水平(＞0.05),但表现出纯合子AA基因型个体的失水率低于纯合子GG基因型个体,其他指标则高于纯合子GG基因型个体;c.759.T＞A位点纯合子TT基因型个体的血清总胆固醇、总蛋白和白蛋白显著高于纯合子AA基因型

表2 2个SNP位点基因型频率和等位基因频率

表3 CYP7A1基因对白羽番鸭肉质和血清生化指标的影响

个体(P＜0.05),杂合子AT基因型个体总胆固醇和白蛋白显著高于纯合子AA基因型个体(P＜0.05),杂合子AT基因型个体总胆固醇显著高于纯合子TT基因型个体(P＜0.05),其他基因型个体性间差异未达到显著水平(P＞0.05)。

3 讨 论

在人类的研究中表明,人类疾病如肝硬化、动脉粥样性硬化、脑血栓等及其对药物的治疗反应与CYP7A1基因多态性存在相关性,同时多种核受体与CYP7A1组成转录抑制/激活网络,维持体内胆汁酸和脂质动态平衡［6］。在动物界的研究中,对大鼠和小鼠CYP7A1的研究报道较多［7］,但在家禽上的报道极少。兰旅涛等［8］运用同源序列克隆结合RACE技术首次报道了鸭CYP7A1基因cDNA序列,该基因在肝脏中呈高丰度表达,在其他组织中表达量极低,表明该基因的表达具有组织特异性。杨堃［9］通过RACE法获得了鹅CYP7A1基因序列,该基因在超饲养条件下其表达受到抑制。李万贵等［10-11］采用PCR-SSCP和DNA直接测序技术在兴义鸭CYP7A1基因外显子3检测到5个同义突变的SNPs∶G744A、G783A、T858C、C951G和G960A,它们对血清白蛋白、球蛋白和总蛋白有显著效应;在樱桃谷鸭CYP7A1基因编码区87～246 bp区域检测到c.129C＞T沉默突变,该突变对肌内脂肪和血清总胆固醇产生显著影响,但这一突变没有在金定鸭和兴义鸭中检测到。

本研究首次对番鸭CYP7A1基因多态性进行检测,发现了c.294.A＞G和c.759.T＞A 2个SNP,均为沉默突变,2个SNP位点的多态信息含量均处于0.25～ 0.5,按Botstein等［12］划分标准,均为中度多态座位。研究表明,高度多态最有利于群体遗传分化,中度多态次之,低度多态则不易于群体遗传分化［13］,因此,2个SNP位点在番鸭育种中对于群体遗传分化上是较为有利的。关联分析显示,c.294.A＞G位点对研究中所测性状没有产生显著影响,c.759.T＞A位点对血清总胆固醇、总蛋白和白蛋白有显著效应。在人类和小鼠的研究中表明,CYP7A1与胆固醇含量呈负相关,CYP7A1的活性有利于胆固醇向胆汁酸的转化,对胆固醇引起的相关疾病有重要调节作用［14］。同时,潘兰兵等［15］报道,血清中总胆固醇、总蛋白和白蛋白呈正相关。因而,c.759.T＞A位点可能作为选择高低胆固醇的2个分化群体的选择性标记。然而,由于没有开展c.759.T＞A位点产生的3种基因型个体的表达比较分析和群体分化等研究,其作为标记选择育种还只是停留在预测上。与此同时,样本数较少也是制约结果可靠性的一个关键因素,特别是c.759. T＞A位点AA基因型和c.294.A＞G位点GG基因型个体少,结果代表性不理想,不能完全肯定或否定c.759. T＞A和c.294.A＞G位点的遗传效应,这需要进一步扩大样本数和更多的实验来加以证实(如表达研究等),还需要进一步筛查番鸭CYP7A1基因其他区域的多态性,进行全基因SNP单倍型分析,找到更有利于番鸭育种的单倍型,在提高番鸭的育种进程上会更有意义。

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Effect of the CYP7A1 Gene Polymorphism on Meats Quality and Serum Biochemical Indexes in Muscovy Ducks

ZHANG Yi-yu,LI Wan-gui,WANG Dan-dan
(College of Animal Science,Guizhou University,Key Laboratory of Animal Genetics,Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region,Ministry of Education,Guizhou University,Guizhou Guiyang 550025,China)

CYP7A1(cholesterol 7-alpha hydroxy-lase,CYP7A1)is the rate-limiting enzyme produced the bile acid with cholesterol.The research investigated the polymorphism of CYP7A1 gene by PCR-SSCP methods and DNA sequencing in Muscovy ducks,analysis on the correlation with meats quality and serum biochemical index.The results indicated that the silent mutation c.294 A＞G was detected,and it formed 3 genotype AA,AG and GG, AG and A was dominant genotype and allele respectively,the frequency was 0.5517 and 0.6107 respectively.The silent mutation c.759.T＞A was investigated in exon 3,TT and T was dominant genotype and allele respectively,the frequency was 0.6552 and 0.7931 respectively,all of 2 SNPs belonged to moderate polymorphism and genotype distribution located in Hardy-Weinberg equilibrium.The correlation results showed that c.294.A＞G mutation have significant effect on meat quality and serum biochemical levels,c.759.T＞A mutation also have significant effect on total cholesterol,total protein and albumin,A was the beneficial allele for low level serum total cholesterol,which may be a marker assisted site for breeding low cholesterol Muscovy duck.

CYP7A1 gene;meat quality;muscovy duck;serum biochemical level

S834.2

A文献标识码:0258-7033(2015)11-0005-05

2014-11-19;

2015-01-01

国家自然科学基金项目(31160453);贵州大学博士基金项目 [贵大人基合字(2010)037]

张依裕(1976-),男,博士,副教授,硕士生导师,从事动物遗传资源保护与利用研究,E-mail:zyy8yyc@163.com