五星黄鸡BMP15基因多态性与产蛋性能关联性分析

凡文磊，刘红举，郑麦青，刘冉冉，李庆贺，文 杰，赵桂苹

(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

五星黄鸡BMP15基因多态性与产蛋性能关联性分析

凡文磊，刘红举，郑麦青，刘冉冉，李庆贺，文 杰，赵桂苹*

(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

为研究五星黄鸡骨形态发生蛋白15(BMP15)基因多态性及其与产蛋性能的相关性，采用直接测序法检测五星黄鸡BMP15外显子多态性。结果表明:五星黄鸡在BMP15外显子1和外显子2中分别存在4个和9个多态位点，其中，外显子1的C34T突变和外显子2的T424C突变为错义突变，分别导致亮氨酸变为苯丙氨酸和甘氨酸变为丝氨酸，其他均为同义突变;突变位点与300日龄产蛋量的关联分析表明，H系C34T的TT基因型比CT基因型产蛋数多9.6枚(P＜0.05);而L系G540A的AA基因型产蛋数比GA基因型高16.7枚(P＜0.05)，其他位点在2个品系中与产蛋数相关性差异不显著(P＞0.05);单倍型分析结果表明，H系BMP15基因不同单倍型组合与300日龄产蛋量的相关性未达到显著水平，L系单倍型组合Block1中L4L4和Block3中L1L1产蛋数远高于其他单倍型组合(P＜0.05或P＜0.01)。本研究结果表明，BMP15基因多态性能显著影响五星黄鸡产蛋性能，上述多态位点和单倍型组合可能成为潜在的分子标记用于鸡产蛋性能的提高。

BMP15;单核苷酸多态性;五星黄鸡;产蛋性能

产蛋性能作为影响肉种鸡繁殖潜力和利用效率重要性状,越来越多的受到重视。产蛋量是多基因控制的复杂形状,具有较低遗传力(0.12～0.42),并受环境、饲养管理、营养等多重因素影响。应用常规育种手段对此类性状进行选育,具有成本高、进展慢等诸多缺陷。近年来,分子标记辅助选择已成为加速低遗传力性状选育进程的有效手段［1-2］。目前,已发现鸡催乳素(PRL)及其受体(PRLR)等基因的多态性都与产蛋性能存在密切联系［3-4］。

BMP15,亦称生长分化因子9B(growth/differentiation factor 9B,GDF9B),是转化生长因子β(TGF-β)超家族的成员［5］。BMP15基因在多个物种间具有较高的保守性,均由2个外显子和1个较长的内含子组成。BMP15在卵母细胞中特异性表达,通过影响卵泡发育和成熟来调节雌性哺乳动物的繁殖性能［5-6］。敲除BMP15基因将引起小鼠生殖障碍［7］。人BMP15基因704处发生A-G突变与卵巢发育不全导致的妇女高促性腺激素卵巢功能衰竭有关［8］。Galloway等［9］发现,在Hamra绵羊和Inverdale绵羊中,BMP15基因FecX1突变为杂合的绵羊排卵数上升,可以产2～3只羔羊,而BMP15突变为纯合会导致原发性卵巢功能障碍,进而导致繁殖力下降。目前,卵生动物BMP15的研究仍然较少。

本实验以国家审定品种五星黄鸡H系和L系母鸡为研究对象,通过直接测序的方法检测2个配套系群体中BMP15单核苷酸多态性,并将多态性位点与产蛋性能进行关联性分析,发掘与产蛋性能相关的分子标记,为五星黄鸡产蛋性能的选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 五星黄鸡配套系2011年获得国家新品种证书,由三系配套(A系、H系、L系)。本研究以H系和L系母鸡各300只为实验素材。所有参试母鸡为同一批次,相同条件下饲养,记录并统计2个品系母鸡300日龄产蛋数,翅下静脉采集血液约1 mL,阿氏液抗凝,-20℃冻存、备用。

1.2 基因组DNA提取 酚-氯仿法提取基因组DNA,TE溶解,核酸测定仪检测浓度和纯度,-20℃保存备用。

1.3 引物设计和PCR扩增 根据GenBank公布的原鸡基因DNA序列(GenBank_NO∶NC_006091),用Primer5.0软件设计覆盖外显子1和2的引物3对,引物由华大基因科技有限公司合成,引物信息见表1。

表 鸡BMP15基因外显子扩增所用引物

表 鸡BMP15基因外显子扩增所用引物

引物 引物(5′→3′) 产物长度/bp引物1 F:CGGGACCTCTTTCTGCTTTA 593 R:ACCAACATCTCCAAGCCAAG引物2 F:CTGGCACAGGAAATGGAAC 659 R:GATGATCCAATGGTCCCAAC引物3 F:TGAAGCTGAGCACCTTCTCC 833 R:GCATCGAGTGGAGACAAACC

PCR扩增条件∶94℃预变性5 min;94℃变性1 min,60℃复性30s,72℃延伸45s,35个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 SNPs位点的检测和基因分型 为确定突变位点及突变类型,2个品系各随机抽取15个样本DNA进行PCR扩增,扩增产物经ABI3730测序仪测序进行单个测序,而后用DNAstar和MegAlign软件对测序结果进行分析,依据分析结果建立基因分型模式。最后根据建立的基因分型模式对剩余样本测序结果进行分析。

1.5 统计分析 应用Excel软件分别计算基因型频率、等位基因频率,并进行卡方检验,判断多态位点是否偏离Hardy-Weinberg平衡。利用Haploview 4.0、Phase 2.1软件进行单倍型分析。采用SAS(8.0)中的GLM程序对基因多态性及其单倍型组合与两品系300日龄产蛋量分别进行关联分析,结果均以平均值±标准误表示。建立单因素方差分析模型如下∶

式中,Yijk为个体表型的记录值;u为群体平均值;Gk为第k种基因型的固定效应,k=1,2,3;eijk为随机误差。

2 结 果

2.1 突变位点分析 2个品系共30个样本PCR产物的测序结果见图1。外显子1有4个位点发生突变,分别为C34T、A111G、C231T、C240T,其中C34T突变导致亮氨酸变为苯丙氨酸,其余突变均为同义突变。外显子2有9个突变位点,分别为C177T、A234G、C294T、C348T、T360C、T423C、G424A、G540A、C579T,其中G424A突变导致甘氨酸变为丝氨酸,其余突变均为同义突变。

2.2 群体遗传学分析 H系和L系有完整实验记录的试验鸡共495只(其中H系278只,L系217只),根据分型结果统计分析了13个多态性位点在2个品系中的基因型频率、等位基因频率,并对各多态位点基因型进行了卡方检验(表2和表3)。结果显示,外显子1的4个突变位点在2个群体中均极显著偏离哈代-温伯格平衡(＜0.01),而外显子2的9个突变位点均符合哈代-温伯格平衡(＞0.05)。此外,13个突变位点中,C348T和T423C突变型等位基因频率明显高于野生型,且L系中T423C突变位点未检测到野生型纯合子。

2.3 单倍型及单倍型频率分析 利用Haploview 4.0和Phase 2.1软件对13个多态位点进行分析,结果发现H系有2个单倍型模块,其中Block1包含C1839050T、C1839059T和C1839983T3个突变位点, Block2包含A1840040G和C1840100T 2个突变位点;L系有3个单倍型模块,前两个与H系相同,Block3包含G1840246A和C1840385T 2个突变位点(如图2和图3)。H系和L系共495只试验鸡构建的3个单倍型模块中,H系Block1中发现了5种单倍型、10种单倍型组合,Block2中发现了4种单倍型、7种单倍型组合;L系Block1中发现了4种单倍型、8种单倍型组合,Block2中发现了4种单倍型、6种单倍型组合,Block3中发现了3种单倍型、6种单倍型组合。各单倍型及单倍型频率见表4和表5。

2.4 单个突变位点与产蛋性状的相关分析 对五星黄鸡H、L系各突变位点不同基因型分别与300日龄产蛋数进行关联分析,H系C34T突变TT基因型比CT基因型产蛋数多9.6枚(＜0.05),其余位点不同基因型个体之间产蛋数差异不显著。L系外显子2中突变位点G540A中AA基因型产蛋数比GA基因型高16.7枚(＜0.05),其余位点不同基因型个体产蛋数无显著差异(见表6,仅列出了差异显著位点关联分析结果)。

图 BMP15基因突变位点测序图

表 H系BMP15基因多态位点群体遗传学分析

表 H系BMP15基因多态位点群体遗传学分析

注∶显著水平χ20.05=5.99,χ20.01=9.21。下表同

位点 基因型频率(个体数) CC/AA CT/AG TT/GG C(A) T(G) C34T 0.7806(217) 0.1007(28) 0.1187(33) 0.8309 0.1691 114.4110 A111G 0.6835(190) 0.1978(55) 0.1187(33) 0.7824 0.2176 48.8101 C231T 0.8094(225) 0.1259(35) 0.0647(18) 0.8723 0.1277 52.5749 C240T 0.8237(229) 0.0755(21) 0.1007(28) 0.8615 0.1385 129.8480 C176T 0.4892(136) 0.4209(117) 0.0899(25) 0.6996 0.3004 0.0005 A233G 0.4676(130) 0.4245(118) 0.1079(30) 0.6799 0.3201 0.1725 C293T 0.5216(145) 0.3921(109) 0.0863(24) 0.7176 0.2824 0.2945 C347T 0.1043(29) 0.4461(124) 0.4496(125) 0.3273 0.6727 0.0460 T359C 0.5468(152) 0.3885(108) 0.0647(18) 0.7410 0.2590 0.0409 T423C 0.7878(219) 0.205(59) 0.0072(2) 0.8903 0.1097 0.8538 G424A 0.0971(27) 0.4964(138) 0.4065(113) 0.3453 0.6547 2.6629 G540A 0.0072(2) 0.1403(39) 0.8525(237) 0.0773 0.9227 0.0803 C579T 0.3022(84) 0.5216(145) 0.1762(49) 0.5629 0.4371 0.9997等位基因频率 χ2

表 L系BMP15基因多态位点群体遗传学分析

表 L系BMP15基因多态位点群体遗传学分析

位点 基因型频率(个体数) CC/AA CT/AG TT/GG C(A) T(G) C34T 0.8203(178) 0.0783(17) 0.1014(22) 0.8594 0.1406 99.0861 A111G 0.7005(152) 0.1751(38) 0.1244(27) 0.7880 0.2120 49.1351 C231T 0.8249(179) 0.0875(19) 0.0875(19) 0.8687 0.1313 82.4138 C240T 0.7189(156) 0.1429(31) 0.1382(30) 0.7903 0.2097 70.2467 C177T 0.5853(127) 0.341(74) 0.0737(16) 0.7558 0.2442 1.2625 A234G 0.318(69) 0.4931(107) 0.1889(41) 0.5645 0.4355 0.0018 C294T 0.3917(85) 0.4424(96) 0.1659(36) 0.6129 0.3871 0.9937 C348T 0.0138(3) 0.3687(80) 0.6175(134) 0.1982 0.8018 5.5634 T360C 0.0737(16) 0.2995(65) 0.6267(136) 0.2235 0.7765 4.0740 G424A 0.1198(26) 0.3733(81) 0.5069(110) 0.3065 0.6935 3.2232 T423C 0.9078(197) 0.0922(20) 0.9539 0.0461 0.5064 G540A 0.0323(7) 0.235(51) 0.7327(159) 0.1498 0.8502 1.2924 C579T 0.318(69) 0.5299(115) 0.1521(33) 0.5829 0.4171 1.7540等位基因频率 χ2

图2 H系单倍型模块图

图3 L系单倍型模块图

2.5 不同单倍型组合与产蛋性状的相关分析 H系 2个单倍型模块中不同的单倍型组合300日龄产蛋数差异不显著。L系Block 1中单倍型组合L4L4产蛋数高于L1L1、L1L2、L1L3、L1L4、L2L2、L2L3、L3L3组合(＜0.05);Block 3中L1L1组合产蛋数显著高于L1L2、L1L3、L2L2组合(＜0.05),Block2中各单倍型组合产蛋数差异均不显著(见表7,相关性不显著的单倍型模块未在表中列出)。

表4 H系单倍型及单倍型频率

3 讨 论

表5 L系单倍型及单倍型频率

表6 BMP15基因各突变位点不同基因型与300日龄产蛋数的关联分析

表7 L系单倍型组合与300日龄产蛋数的关联分析

3.4 单倍型组合与产蛋性能的关系单倍型相关性分析 haplotype association analysis与单标记分析相比,具有统计效率高、可进行大范围染色体区段分析而且检测效率高等优势［13］,并且单倍型和性状间的关联分析可以弥补单个SNP与性状关联分析中存在的不足。本研究中,H系单倍型组合之间产蛋数无显著差异;L系Block1中L4L4单倍型组合产蛋数比L1L4组合多22.7枚,Block3中L1L1单倍型组合产蛋数比L1L2组合多18.7枚,差异均极显著;2个品系不同单倍型组合间产蛋数差异不同,可能是由于2个品系血缘较远引起的。另外,有些位点本身与产蛋数没有显著相关性,但几个这样的位点构成单倍型组合后能显著影响产蛋性能,可能是由各位点之间协同作用导致的。

4 结 论

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Association of BMP15 Gene Polymorphisms with Egg Laying in Wuxing-Yellow Chicken

FAN Wen-lei,LIU Hong-ju,ZHENG Mai-qing,LIU Ran-ran,LI Qing-he,WEN Jie,ZHAO Gui-ping*
(Institute of Animal Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China)

In order to analyze the association of BMP15 polymorphisms with egg laying traits in Wuxing-Yellow Chickens. We sequenced exons of BMP15 and carried out polymorphism analysis for BMP15.The results showed that there were 4 SNPs in exon1 and 9 SNPs in exon2,among which C34T in exon1 and T424C in exon2 were both missense mutations,and resulted in mutation of Leu34Phe and Gly424 Ser,respectively.The relationship between polymorphic sites and egg production number of 300 d (EN-300 d)was analyzed by General Linear Model.In H line,three genotypes(CC,CT,TT)were found at C34 T mutation locus,in addition,individuals with TT genotype had significantly higher EN-300 d than that with CT genotype(P＜0.05).In L line,three genotypes(GG,GA,AA)were identified at G540A mutation locus and individuals with AA genotype has significantly higher EN-300 d than GA genotype(P＜0.05).No significant association was found between other mutations and EN-300 d in both lines(P＞0.05).Haplotype analysis showed that there was no significant association between diplotypes and EN-300 d in H line,while individuals with diplotypes L4L4 in block1 and L1L1 in block3 had significantly higher EN-300 d than others(P＜0.05 or P＜0.01)of L line.In conclusion,the polymorphisms of BMP15 have asignificant association with egg production of Wuxing-Yellow Chicken,indicating that the above loci and diplotypes could be potential DNA markers for improvement of egg production of chicken.

BMP15;SNP;Wuxing-Yellow chicken;egg production trait

S831.2

A文献标识码:0258-7033(2015)11-0013-06

2014-11-15;

2014-12-29

中国农业科学院科技创新工程(ASTIP-IAS04);国家肉鸡产业技术体系(CARS-42)

凡文磊(1989-),男,河南人,硕士研究生,主要从事家禽抗病育种研究,E-mail:fwlei123@126.com

*通讯作者:赵桂苹,研究员,E-mail:zhaogniping@caas.cn